光照和肌醇對木霉生長和產脂能力影響

梁峰，王莉，苑嬡，宋兆齊，劉秀花

(1.商丘師范學院生物精煉河南省工程實驗室，河南商丘476000;2.商丘師范學院生命科學學院，河南商丘476000)

光照和肌醇對木霉生長和產脂能力影響

梁峰1，王莉2，苑嬡2，宋兆齊2，劉秀花2

(1.商丘師范學院生物精煉河南省工程實驗室，河南商丘476000;2.商丘師范學院生命科學學院，河南商丘476000)

木霉菌的許多種屬都能夠產生脂類物質，并且已經被用來研究脂類物質的生產.本研究主要探索光照和肌醇對木霉生物量積累和油脂量積累的作用.結果表明:與遮光處理組相比，正常光照培養(yǎng)條件更易于菌株成熟孢子的形成，并且正常光照培養(yǎng)也利于菌株L1生物量和油脂量的積累;肌醇的添加會促進菌株生物量的積累，但是對菌株L1油脂量的積累有一定的抑制作用，對菌株L2，相比無肌醇添加組，肌醇的添加在一定的培養(yǎng)時間上有利于油脂的形成.同時發(fā)現光照和肌醇能夠影響木霉的脂類構成.

霉菌;黑暗;肌醇;中性脂;生物柴油

微生物油脂(microbial oil)又稱單細胞油脂(single cell oil，SCO)，是由酵母、霉菌、細菌和藻類等微生物在一定條件下將碳水化合物、碳氫化合物和普通油脂等碳源轉化為菌體內大量貯存的油脂及一些具有特殊功能的脂質.某些微生物在一定條件下能將碳水化合物、碳氫化合物和普通油脂等轉化為菌體內大量貯存的油脂，如果油脂含量超過細胞干重的20%，則此微生物稱為產油微生物.利用產油微生物生產生物柴油是一項具有廣泛應用前景的技術.

1980年WIDDENP等［1］研究發(fā)現，木霉在土壤生物量中占有較大的比例，較易分離獲得［2］.木霉菌的許多種屬已經被用來研究脂類物質的產生，木霉所能產生的脂肪酸種類主要為16C飽和脂肪酸，18C單不飽和脂肪酸和18C多不飽和脂肪酸等［3］.目前國內外利用微生物發(fā)酵作物秸稈生產微生物油脂存在兩大瓶頸［4］.第一，秸稈的主要成分木質纖維素難以被降解，利用效率很低;第二，用于大規(guī)模生產微生物油脂的微生物一般不能利用木質纖維素生長，只能利用簡單的營養(yǎng)物質(淀粉、葡萄糖等)生長發(fā)育，生產成本較高.因此，要想利用微生物轉化農作物秸稈生產生物柴油(biodiesel)，必須首先解決好這兩方面的問題.因此找到一種既能高效降解木質纖維素又能將分解木質纖維素獲得的單糖有效地轉化為脂類物質的微生物成為解決這兩方面問題的關鍵.研究發(fā)現木霉能分泌纖維素酶、半纖維素酶和木質素酶，且酶穩(wěn)定性較好，并能產生和積累微生物油脂［5］，因此，利用木霉開展微生物柴油的研究具有重要理論意義和實用價值.

肌醇(inositol)廣泛存在于各種天然動物、植物及微生物組織中［6］，是一種“生物活素”，參與生物體內的新陳代謝活動，用于多種菌種的培養(yǎng)和促進霉菌的增長［7－8］.本文報道了光照和肌醇對木霉的脂類代謝與積累的影響.

1 材料與方法

1.1 研究材料與培養(yǎng)基

本實驗所使用的菌株是兩株木霉，分別標記為L1、L2，由本實驗室分離保存.研究使用GMY液體培養(yǎng)基［9－10］(1 L含KH2PO48 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，Glucose 40 g，Yeast extract 3 g，調 pH=5.5);GMY 液體 1 L 加瓊脂 15 ～20 g得到固體培養(yǎng)基，GMY－肌醇液體培養(yǎng)基中肌醇(過濾除菌)含量為1 mg/1mL，其它成分同GMY液體培養(yǎng)基.

1.2 研究方法

1.2.1 平板培養(yǎng)與遮光處理

取孢子懸液1小環(huán)點種平板中央，置培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng).L1和L2分別分成2組，正常光照培養(yǎng)和黑暗培養(yǎng).每組接種3塊平板，分別于培養(yǎng)1 d、2 d、3 d時取出觀察菌落形態(tài)和孢子的形成情況，拍照.

1.2.2 搖瓶培養(yǎng)

取GMY40液體培養(yǎng)基100 mL至250 mL三角瓶中，每瓶接種孢子量約為107個，225 rpm搖床28℃恒溫培養(yǎng).木霉L1設黑暗培養(yǎng)和添加肌醇2個實驗組，L2只做添加肌醇處理處理.

1.2.3 脂肪粒染色與觀察

搖瓶培養(yǎng)時間達到1 d、2 d、3 d的時候，分別挑取不同處理方式下的菌絲體進行蘇丹黑染色［11］顯示細胞內脂肪粒，顯微攝影獲得圖片.根據菌絲體中脂肪粒的大小和密度定性判斷兩株霉菌在不同培養(yǎng)時間和培養(yǎng)條件下的脂肪粒積累情況.

1.2.4 生物量測定

培養(yǎng)時間分別達到1 d、2 d、3 d時，將不同處理方法的搖瓶取出，菌絲體挑取完成后，抽濾、凍干得干菌體.

1.2.5 脂肪含量測定

分別采用索氏抽提法［12］熱酸解［13］提取微生物油脂.提取的油脂經重量分析后，用石油醚從提取瓶中溶出并定容備用.

1.2.6 油脂薄層層析(TLC)［14］

2 結果與分析

2.1 光照對兩株木霉L1、L2生長和產脂能力的影響

正常光照處理和遮光處理對兩株木霉L1、L2生長和產孢子能力的影響較大.如圖1所示，培養(yǎng)2 d后，L1遮光與自然光照條件下都能長滿平板并出現成熟孢子，光照條件下生長情況要快于遮光處理，成熟孢子的形成更加明顯;L2兩種處理下2 d尚未出現成熟孢子.培養(yǎng)3 d后，L1兩種培養(yǎng)條件下的進一步生長，成熟孢子大面積形成，但是正常光照條件仍然優(yōu)于遮光;正常光照培養(yǎng)條件下的L2已經出現成熟孢子，黑暗培養(yǎng)條件下尚無成熟孢子的出現.由L1、L2的生長情況可以得知，光照條件下有利于成熟孢子的形成，光照有利于木霉的生長與繁殖.

2.1.1 光照對菌株L1細胞脂肪粒形成的影響

木霉L1菌株在液體GMY震蕩培養(yǎng)時完全黑暗和正常光照不同條件下細胞內脂肪粒的數量和大小有一定的變化.如圖2所示，經蘇丹黑染液染色后，脂肪顆粒被染成藍黑色，顆粒的大小和多少代表油脂積累的程度.可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，兩種處理條件下的油脂顆粒的體積都會變大、數量都會增多.但是同一培養(yǎng)時間點正常光照培養(yǎng)條件下L1菌絲體中的脂肪粒較遮光條件下的數量多體積大，即油脂含量高，說明正常光照促進油脂顆粒的形成.

2.2 肌醇對木霉L1、L2脂肪粒形成的影響

肌醇對菌株L1脂肪粒形成有一定的影響.如圖2所示，L1在GMY培養(yǎng)基和添加肌醇(1mg/1mL)的GMY培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，隨著發(fā)酵時間的延長油脂顆粒的體積都會變大、數量都會增多.但是同一時間點在正常光照培養(yǎng)條件下且無肌醇添加時，L1菌絲體中的藍黑色顆粒較多，即油脂含量高，說明肌醇的添加會減少油脂顆粒的形成.

肌醇對菌株L2脂肪粒形成有一定的影響.圖2可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，油脂顆粒體積會變大、數量會增多，并且培養(yǎng)時間分別為1 d、3 d時，均是在正常光照培養(yǎng)條件下且無肌醇添加時，L2菌絲體中的藍黑色顆粒較多，即油脂含量高，但是培養(yǎng)時間為3 d時，菌株L2在以含有肌醇的培養(yǎng)基中，脂肪顆粒的體積較另一組大;培養(yǎng)時間為2 d時，菌株L2在以含有肌醇的培養(yǎng)基中，脂肪顆粒的數量較另一組多，即油脂含量高.

2.3 光照和肌醇對木霉生物量的影響

光照對L1的生物量影響不大，而肌醇對菌株L1生物量的影響在培養(yǎng)的后期較明顯.如圖3所示，菌株L1在三種處理條件下，隨著發(fā)酵時間的增加，生物量越來越多.與正常培養(yǎng)條件組相比，添加肌醇后，培養(yǎng)時間為1 d時，二者生物量無明顯差異;2 d時生物量略高于正常培養(yǎng);3 d時肌醇組生物量明顯高于正常培養(yǎng)組是前者的1.16倍.黑暗培養(yǎng)與正常培養(yǎng)相比，在不同時間點生物量均無較大差別.

圖1 光照對L1、L2生長能力的影響Figure 1 The influence of light on growth ability of strain L1、L2

圖2 木霉L1和L2菌體細胞脂肪粒顯微圖片菌株Figure 2 Micrographs of cells with lipid globules of strain L1 and L2

肌醇對菌株L2生物量影響的較小.如圖4所示，菌株L2，在兩種處理條件下，隨著發(fā)酵時間的增加，生物量越來越多，并且添加肌醇后，在培養(yǎng)時間為2 d、3 d時，肌醇添加組生物量都略高于對照組.

2.4 光照和肌醇對木霉產脂能力的影響

光照和肌醇對菌株L1油脂產量都有明顯的抑制作用.由圖5可以看出，菌株L1在三種處理條件下，隨著發(fā)酵時間的增加，油脂產量越來越高，與圖2、圖3蘇丹黑染色結果吻合.與正常組相比，添加肌醇后，培養(yǎng)時間為1 d時，二者油脂產量無明顯差異;2 d時，正常培養(yǎng)油脂產量明顯高于肌醇添加組，是后者的1.97倍;3 d時是后者的的1.63倍.說明1mg/mL肌醇的添加不利于脂肪顆粒的形成.黑暗組與正常培養(yǎng)組相比，在培養(yǎng)時間為1 d時，前者油脂產量略高;但是，2 d時反而正常培養(yǎng)組是遮光組的2.79倍;3 d時是遮光組的2.07倍.說明在培養(yǎng)時間段的后續(xù)培養(yǎng)中，遮光處理不利于脂肪顆粒的形成.

圖3 光照和肌醇對L1菌株生物量的影響Figure 3 Light and inositol impact on the biomass of L1 strains

圖4 肌醇對L2菌株生物量的影響Figure 4 Inositol impact on the biomass of L2 strains

圖5 光照和肌醇對L1菌株油脂產量的影響Figure 5 Light and inositol impact on the lipid production of L1 strains

圖6 肌醇對L2菌株油脂產量的影響Figure 6 Inositol impact on the lipid production of L2 strains

圖7 索氏提取得菌株L1中性脂的薄層層析圖譜Figure 7 TLC of L1 non－polar lipids of Soxhlet extraction

CE:膽固醇脂;TAG:三油酸甘油脂(甘油三酯);DAG:二油酸甘油脂(甘油二酯);PL:磷脂;“+”表示實驗采用該處理方式，“－”表示實驗未采用該處理方式.

肌醇對木霉L2油脂產量影響呈現早期促進后期抑制的現象，但影響程度沒有L1的大.由圖6可以看出正常培養(yǎng)油脂產量隨時間的增加而增高，而添加肌醇時，培養(yǎng)時間為3 d時，油脂產量較2 d時低，與圖2蘇丹黑染色結果吻合.1 d時，正常組油脂產量是肌醇組的2.75倍;2 d時肌醇組油脂產量是正常組的1.33倍;3 d時，正常組油脂產量是添加組的1.54倍.說明在特定的培養(yǎng)時間段肌醇在木霉產脂能力上的調控，對菌株L2的調控不同于菌株L1，對菌株L2的調控在早期就顯現出來.

2.5 光照和肌醇對木霉油脂成分的影響

由圖7可以看出，三種條件下的菌株L1中油脂的主要成分是甘油三酯和磷脂，正常組甘油三酯的含量是先增加后減少，磷脂的含量是先減少后增加;與正常組相比黑暗組甘油三酯的含量是一直增加，磷脂的含量是一直減少(圖7A);與正常組組相同，添加肌醇組甘油三酯的含量也是先增加后減少，磷脂的含量卻是一直增加(圖7B).

由圖7C所示，L2在兩種條件下的菌株中油脂的主要成分是甘油三酯和磷脂，正常組甘油三酯的含量是一直增加，磷脂的含量是一直減少;與正常組相同，添加肌醇組甘油三酯的含量也是一直增加，磷脂的含量是一直減少.

3 討論

平板培養(yǎng)菌株L1在培養(yǎng)時間為3 d時，兩種培養(yǎng)條件下的L1雖然都有成熟孢子形成，但是與正常光照組相比，可以明顯看出遮光培養(yǎng)條件不利于木霉成熟孢子的形成，即不利于木霉的生長.菌株L2的培養(yǎng)情況可以進一步證實該結論.

搖瓶培養(yǎng)時，由顯微鏡下的鏡檢圖像顯示，與正常光照組相比，遮光處理下，菌絲體內的藍黑色顆粒較少，說明遮光處理不利于油脂顆粒的積累;從油脂量的定量分析上，2 d時，無論是定性還是定量，都可以得出遮光處理不利于油脂顆粒的積累.搖瓶培養(yǎng)條件下，對于菌株L1，與正常光照組相比，肌醇添加后菌絲體內的藍黑色顆粒較少，說明肌醇的添加不利于油脂顆粒的積累;從油脂量的定量分析上，無論是定性還是定量，都可以得出肌醇的添加不利于菌株L1油脂顆粒的積累.肌醇對菌株L2產脂能力的影響不同于L1，肌醇對菌株L2的調控在早期就顯現出來.

進一步研究多個木霉菌株可以驗證上述推斷是否在木霉屬真菌有普遍性.本文只研究了黑暗條件和100 mg/100 mL肌醇濃度對菌株L1和L2生長和產脂能力的影響，可以進一步研究更高濃度或更低濃度的肌醇或遮光處理中給予間斷光照刺激對木霉生長和產脂能力的影響，以找到發(fā)酵產脂的最佳工藝方案，從而獲得最好的微生物油脂產品.

［1］ Widden P，Abitbol J.Seasonality of Trichoderma species in aspruce－forest soil［J］.Mycologia，1980，72:775 －784.

［2］ 楊合同.木霉的分類與鑒定［M］.北京:中國大地出版社，2009.374－378.

［3］ Ruiz N，Dubois N ，Wielgosz－Collin G.Lipid content and fatty acid composition of a marine derived Trichoderma Longibrachiatum strain cultured by agar surface and submerged fermentations［J］.Process Biochem，2007，42(4):673－680.

［4］ Ratledge C.Microbial Lipids Vol 2［M］.London:Academic Press，l989.567 －668.

［5］ K S Tyson.Biodiesel research pmgress 1992—1997［J］.NREL Technical Report，NRER/TP －580－24443，1998.

［6］ 汪多仁.肌醇的開發(fā)與應用進展［J］.化工中間體，2002(18119):23－25.

［7］ 劉曉勇，錢和，劉建利.肌醇研究近況與展望［J］.江蘇食品與發(fā)酵，2003(4):7－10.

［8］ 黃海東，趙良啟，李曉雁.篩選聚羥基烷酸產生菌的一種方法［J］.生物技術，2004，14(2):29－30.

［9］ Fisher D B，Wang N.Sucrose Concentration Gradients along the Post－Phloem Transport Pathway in the Maternal Tissues of Developing.Detection of cerebral myo－inositol［J］.Febsletters，1995，18(1):107 － 172.

［10］ Shi Y，Shu L，Su S.Juvenile tilapia or eochromisnilocus O reochnm is requirements dielay myo－inositol for maximal growth［J］.Aquaculture，2005，243:273－277.

［11］ 劉波，孫艷，劉永紅.產油微生物油脂生物合成與代謝調控研究進展［J］.微生物學報，2005，45(1):153－156.

［12］ Betina V，Koman V.Changes in the Lipid Composition during the Photo － Induced Conidiation of Trichoderma viride［J］.Folia Microbiol，1980，25:295 －300.

［13］ 阮元，李文.索氏提取法測定農產品中脂肪含量實驗中的幾個注意事項［J］.農家之友，2009(11):18－19.

［14］ 姚乾元.薄層層析法及其應用［J］.化學通報，1962(8):9－15.

Light and inositol effect on the growth and lipid production of two trichoderma sp.strains

LIANG Feng1，WANG Li2，YUAN Ai2，SONG Zhaoqi2，LIU Xiuhua2
(1.Biorefinery Engineering Lab of Hena Province，Shangqiu Normal University，Shangqiu 476000，China;2.Department of Life Science，Shangqiu Normal University，Shangqiu 476000，China)

The method of microbial biosynthesis in vivo in order for the preparation of Microbial Oil is a new path in development of oil resources.In order to optimize the fermentation conditions，first，the experiment use cell morphological and cytochemical methods(Sudan Black staining)for primary screening of two Trichoderma strains under different culture conditions.The results show that:under normal lighting culture conditions ，L1 strain grows by GMY40 liquid medium for the culture medium，pH 5.5，28℃ fermentation for 3 days，bringing about microbial fat content 15.11%，the biomass 9.62 g/L，oil yield 1.45 g/L .Coordinate expression is that Light and inositol can affect the lipid composition of Trichoderma by TLC analyze method.

mycete;darkness;inositol;neutral lipide;biodiesel

2014－04－15;

2014－04－22

梁峰(1966－)，男，河南永城人，商丘師范學院教授，博士，主要從事生物質能源的研究.

Q939.21+7

A

1672－3600(2014)06－0060－05

【責任編輯:徐明忠】