肺泡灌洗液二代測(cè)序在學(xué)齡兒童大葉性肺炎病原學(xué)診斷中的應(yīng)用

何 敏，楊景龍，史瑞明，黃燕萍

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，陜西 西安 710061)

大葉性肺炎是兒童下呼吸道感染性疾病中較常見的一種，臨床起病急，病情重，病程長(zhǎng)，易發(fā)生肺外并發(fā)癥，近幾年來發(fā)病呈逐漸增多的趨勢(shì)[1]。肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌是其感染的主要病原。傳統(tǒng)的病原學(xué)診斷方法，例如咽拭子、痰培養(yǎng)、血清病原抗體檢測(cè)、血培養(yǎng)等，尚不能滿足臨床快速、精準(zhǔn)治療的需求。宏基因二代測(cè)序(metagenomics next-generation sequencing，mNGS)可及時(shí)、準(zhǔn)確地進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)，對(duì)指導(dǎo)臨床診斷、治療具有重要作用[2]。本研究應(yīng)用電子纖維支氣管鏡對(duì)一組大葉性肺炎患兒行支氣管肺泡灌洗，檢測(cè)肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中的病原情況，并對(duì)病原學(xué)和臨床特征進(jìn)行回顧性分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年8月至2020年2月在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院治療的24例學(xué)齡期大葉性肺炎患兒為研究對(duì)象，按照是否采用肺泡灌洗液二代基因測(cè)序檢測(cè)病原分為研究組和對(duì)照組各12例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①大葉性肺炎患兒的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考諸福棠《實(shí)用兒科學(xué)》及兒童社區(qū)獲得性肺炎診療規(guī)范[3-4]，患兒具有發(fā)熱、咳嗽等表現(xiàn)，經(jīng)聽診、胸片或CT、血常規(guī)檢查確診為大葉性肺炎；②本研究獲得患兒家長(zhǎng)的知情同意、我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有凝血功能疾病、貧血；②伴有腫瘤疾病；③支氣管畸形；④氣管異物；⑤長(zhǎng)期應(yīng)用免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素的患兒；⑥因各種原因無法接受支氣管肺泡灌洗。

1.2 研究方法

研究組采用傳統(tǒng)方法及肺泡灌洗液二代基因測(cè)序檢測(cè)病原，對(duì)照組只采用傳統(tǒng)方法檢測(cè)病原。具體為兩組行支氣管鏡后采集肺泡灌洗液送檢一般細(xì)菌培養(yǎng)，結(jié)核桿菌、真菌、細(xì)菌涂片，研究組在此基礎(chǔ)上送檢肺泡灌洗液mNGS。

支氣管肺泡灌洗方法：參考國(guó)內(nèi)兒科纖維支氣管鏡指南[5]，術(shù)前6 h禁食，選用Olympus BF260電子支氣管鏡，予以靜脈鎮(zhèn)靜加局部麻醉的方法，采用2%利多卡因咽喉部局麻，纖維支氣管鏡經(jīng)鼻、咽喉、聲門進(jìn)入氣道，觀察支氣管形態(tài)，37℃生理鹽水灌洗至炎癥嚴(yán)重的肺段，1.0mL/kg至少灌洗3次，隨即負(fù)壓吸引以獲取BALF，標(biāo)本置一次性無菌硅化收集器中，緩慢拔出纖維支氣管鏡。操作過程中予以吸氧，常規(guī)監(jiān)測(cè)血氧飽和度、血壓和心率等，密切觀察患兒呼吸、唇色、面色等情況。

研究組肺泡灌洗液mNGS檢測(cè)方法：BALF外送至深圳華大基因股份有限公司，提取核酸后行PMseq病原微生物DNA高通量測(cè)序，測(cè)序所得的病原序列與病原庫(kù)進(jìn)行對(duì)比得到最終結(jié)果。報(bào)告致病菌的標(biāo)準(zhǔn)參考已有文獻(xiàn)[6]。

此外，收集兩組熱程(發(fā)病至入院前)、影像學(xué)檢查中肺炎病變部位等臨床資料；收集兩組紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)、降鈣素原(procalcitonin，PCT)、凝血功能、肺炎支原體抗體及病毒抗體檢測(cè)等指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料及臨床特征比較

兩組患兒年齡、性別、肺炎范圍比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；研究組熱程較長(zhǎng)，累及肺葉較多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2/t值分別為5.716、6.972，P<0.05)，見表1。

表1 研究組與對(duì)照組一般資料及臨床特征比較Table 1 Comparison of general data and clinical features of the children between the two

2.2 血清病原學(xué)檢測(cè)

24例標(biāo)本中血清肺炎支原體抗體(mycoplasma pneumonia，Mp)21例(87.5%)陽性，嗜肺軍團(tuán)菌抗體陽性5例(20.8%)，流感B型抗體陽性2例(8.3%)，合胞病毒抗體陽性1例(4.2%)，研究組與對(duì)照組的病原檢出率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 研究組與對(duì)照組血清病原抗體檢出率[n(%)]Table 2 Comparison of detection rates of pathogen antibodies in serum of the children between the two groups [n(%)]

2.3 肺泡灌洗液涂片及培養(yǎng)

24例患兒BALF細(xì)菌、結(jié)核、真菌涂片均陰性；對(duì)照組菌培養(yǎng)均陰性，研究組菌培養(yǎng)陽性2例(16.7%)，其中1例BALF培養(yǎng)為肺炎鏈球菌，1例痰培養(yǎng)及BALF培養(yǎng)均為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSR)。

2.4 肺泡灌洗液mNGS

2.4.1 病原學(xué)分析

研究組肺泡灌洗液mNGS分析顯示，5例單一肺炎支原體拷貝數(shù)陽性，其拷貝數(shù)為19 101～139 304，其余均為混合性感染，具體為EB病毒+肺炎支原體2例(16.7%)，格雷文尼放線菌+肺炎支原體2例(16.7%)，金黃色葡萄球菌+流感嗜血桿菌1例(8.3%)，微小微單胞菌+侵肺戴李斯特菌1例(8.3%)，細(xì)環(huán)病毒16型+肺炎支原體1例(8.3%)；1例金黃色葡萄球菌拷貝數(shù)519，肺泡灌洗液培養(yǎng)為MRSR；另有1例，肺泡灌洗液mNGS肺炎支原體陽性但肺泡灌洗液培養(yǎng)為肺炎鏈球菌，見表3。

2.4.2 肺炎支原體檢出結(jié)果

研究組中1例患兒血清嗜肺軍團(tuán)菌IgM陽性，肺炎支原體抗體陰性而肺泡灌洗液mNGS顯示肺炎支原體序列數(shù)陽性(37 769)；2例入院時(shí)肺炎支原體IgM、IgG定量正常(參考值分別為IgM<1.1，IgG<3.6)，同期肺泡灌洗液mNGS肺炎支原體序列數(shù)分別為120 363、20 276，治療1周后復(fù)查肺炎支原體IgM、IgG定量均升高，IgM分別為3.6、5.1，IgG分別為145、320，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 研究組檢出病原類型Table 3 Pathogen types detected in the study group

2.4.3 病原序列數(shù)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

10例肺炎支原體感染患兒的序列數(shù)與CRP、ESR、住院時(shí)長(zhǎng)有強(qiáng)正相關(guān)性(r值分別為0.891、0.861、0.814，P<0.05)，其中序列數(shù)最高的2例患兒臨床診斷均為重癥難治性支原體肺炎，故在一定程度上表明肺炎支原體載量越大，肺部病變?cè)街兀≡簳r(shí)間越長(zhǎng)。

表4 10例肺泡灌洗液肺炎支原體序列數(shù)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 4 Correlations of sequence number of Mycoplasma pneumoniae in BALF with serological indexes and hospital stay in 10 children

3 討論

3.1 微生物二代測(cè)序指導(dǎo)兒童肺炎病原學(xué)精準(zhǔn)診治

肺炎是兒童期常見的感染性疾病，在全球5歲以下導(dǎo)致兒童死亡的疾病中仍排第1位[7]。早期和快速精準(zhǔn)判斷病原微生物，針對(duì)性使用抗生素治療，對(duì)于有效預(yù)防控制、臨床診治及改善預(yù)后具有十分重要的作用。傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)陽性率低，培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，而抗原/抗體的免疫學(xué)方法、病原體特異核酸序列PCR方法等，僅針對(duì)于已知病原，無法檢測(cè)未知的病原。本研究病原血清學(xué)抗體檢測(cè)僅提示肺炎支原體、嗜肺軍團(tuán)菌、流感病毒、合胞病毒感染，肺泡灌洗液病原學(xué)涂片均陰性，菌培養(yǎng)僅2例陽性，靈敏度較低。在熱程及累及肺炎范圍方面，研究組與對(duì)照組存在差異，原因可能與患兒發(fā)熱時(shí)間越長(zhǎng)、累及肺葉范圍越廣、病情越重，患兒家屬對(duì)mNGS的接受程度越高，此外也與家庭經(jīng)濟(jì)狀況、文化程度等社會(huì)因素有關(guān)，因此存在一定選擇偏倚。

微生物宏基因二代測(cè)序技術(shù)具有準(zhǔn)確性高、通量高的特點(diǎn)，無需微生物培養(yǎng)，直接提取標(biāo)本核算測(cè)序，可檢測(cè)樣本中所有微生物信息，24～36 h即可判斷病原，在敏感性及準(zhǔn)確性方面與傳統(tǒng)的病原檢測(cè)技術(shù)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在臨床醫(yī)療中發(fā)揮重要的作用[8-9]。有學(xué)者使用肺泡灌洗液二代基因測(cè)序34例兒童重癥肺炎，檢出病原32例，陽性率高達(dá)94.1%[10]。另有學(xué)者通過二代測(cè)序檢測(cè)76例重癥肺炎肺泡灌洗液，其靈敏度達(dá)86.84%，顯著高于細(xì)菌培養(yǎng)、免疫熒光、定量PCR等傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)[11]。Takeuchi等[12]研究也表明mNGS可用于呼吸道感染患者BALF中病原體的分子診斷和監(jiān)測(cè)。柯創(chuàng)宏等[13]通過高通量測(cè)序檢測(cè)43例嬰幼兒重癥或疑難細(xì)菌性肺炎的病原體靈敏度較高，并檢測(cè)出經(jīng)普通培養(yǎng)難以獲得的鮑特菌，與本研究結(jié)果一致。

3.2 二代測(cè)序病原序列數(shù)與預(yù)后相關(guān)

近年來Mp感染發(fā)生率呈逐漸增高的趨勢(shì)，本研究12例大葉性肺炎患兒mNGS檢測(cè)BALF中也發(fā)現(xiàn)Mp為主要病原。自2012年全球多地區(qū)發(fā)生Mp暴發(fā)流行，日本、英國(guó)的感染病例也顯著升高[14]。Mp是兒童社區(qū)獲得性肺炎(communityacquired pneumonia，CAP)的重要病原體，可占CAP的10%～30%，Mp流行時(shí)可增加3～5倍[15]。由于Mp對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥等一系列復(fù)雜的機(jī)制使得難治性肺炎支原體肺炎的發(fā)病率增高，常引起肺不張、肺壞死、支氣管擴(kuò)張及閉塞性細(xì)支氣管炎等不良預(yù)后和后遺癥，因此，早診斷、早治療是Mp感染診治的關(guān)鍵。本研究2例入院時(shí)肺炎支原體抗體IgM、IgG均正常，而肺泡灌洗液Mp序列數(shù)均升高，治療1周后復(fù)測(cè)肺炎支原體IgM、IgG陽性，表明mNGS可以更早的發(fā)現(xiàn)Mp。另外，10例支原體肺炎患兒的Mp序列數(shù)與CRP、ESR、住院時(shí)長(zhǎng)有強(qiáng)相關(guān)性，其中序列數(shù)最高的2例患兒臨床診斷均為重癥難治性支原體肺炎，肺部實(shí)變范圍廣，臨床癥狀重，住院時(shí)間明顯延長(zhǎng)。

3.3 病原微生物二代測(cè)序的局限性

眾多研究證明mNGS能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)和鑒定病原體[16-17]，但是仍然存在一些局限性。首先，由于病變的位置和患者的耐受性，通過支氣管鏡檢查獲得的標(biāo)本可能不含有價(jià)值的病原體DNA，繼而會(huì)導(dǎo)致結(jié)果假陰性。在以后的研究中應(yīng)開發(fā)標(biāo)準(zhǔn)化程序以進(jìn)一步提高mNGS的檢測(cè)產(chǎn)出率。其次，由于真菌和細(xì)菌的細(xì)胞壁較厚，在DNA提取過程中采用了破壁處理，這可能會(huì)影響RNA病毒的檢測(cè)。因此，如果懷疑RNA病毒感染，應(yīng)采用RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄程序。此外，mNGS無法區(qū)分定植和致病菌株，檢測(cè)結(jié)果需結(jié)合患兒臨床特征、實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)結(jié)果綜合分析。最后，經(jīng)濟(jì)成本也是限制二代測(cè)序技術(shù)推廣的重要因素。mNGS的平均成本為每份標(biāo)本3 000元左右，與傳統(tǒng)的病原體檢測(cè)相比經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)較大，相信隨著科技的發(fā)展，未來二代測(cè)序檢測(cè)病原體的成本將很快逼近甚至低于血培養(yǎng)等傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)，推動(dòng)其臨床應(yīng)用。

綜上，mNGS可提高兒童大葉性肺炎的病原診斷準(zhǔn)確率，對(duì)臨床治療有指導(dǎo)作用。但本研究是單中心回顧性研究，仍需要更多前瞻性和多中心數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證mNGS分析的準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)診療。