稀釋液中添加半胱氨酸對(duì)絨山羊冷凍精液品質(zhì)的影響

張少華 張曉強(qiáng)

（1張家口市宣化職業(yè)技術(shù)教育中心 河北 張家口 075000；2包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院乳品農(nóng)牧工程系 內(nèi)蒙古 包頭 014035）

在家畜精液的冷凍—解凍過程中，精液的稀釋和冷凍處理各個(gè)環(huán)節(jié)均會(huì)對(duì)精子造成一定的損傷，精液中抗氧化酶類的活力降低是影響精液品質(zhì)的重要因素。在冷凍稀釋液中添加抗氧化劑來(lái)阻止或者是防止氧化應(yīng)激，可降低活性氧對(duì)解凍后精子功能的不利影響。

Bilodeau[1]等證明像半胱氨酸之類的巰醇物質(zhì)，可以保護(hù)冷凍—解凍后的牛精子活力免受過氧化氫的傷害。Funahashia[2]等證明，10℃下添加半胱氨酸可以提高豬精子的活力、頂體完整性和體外穿透性。Andreea[3]等研究發(fā)現(xiàn)，在綿羊冷凍精液稀釋液中VE和半胱氨酸都能顯著提高精子的活力，降低脂質(zhì)過氧化作用。

本試驗(yàn)在稀釋液中分別添加不同濃度半胱氨酸，研究其對(duì)絨山羊細(xì)管冷凍精液品質(zhì)的影響，以篩選更好的冷凍稀釋液配方，提高絨山羊精液冷凍、解凍效果，減少精子損傷，不斷提高絨山羊精液冷凍技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 采精與精子質(zhì)量評(píng)定。在山西右玉縣宏宇種羊場(chǎng)選擇10只體格健壯、性欲旺盛、生殖健康的絨山羊人工采精。預(yù)試期(30 d)種公羊加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，按配種期營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)飼料，每天每只羊飼喂0.5 kg胡蘿卜，0.8 kg全價(jià)配方飼料，1個(gè)雞蛋，優(yōu)質(zhì)青干草自由采食；每天運(yùn)動(dòng)1～2 h。試驗(yàn)開始后每采精2 d休息1 d，采得精液立即送往實(shí)驗(yàn)室在37℃下鏡檢鮮精活率、密度和畸形率；鮮精質(zhì)量要求精子密度大于1.8×109個(gè)/ml，活率大于0.7，畸形率小于10%，檢查合格的精液方可用于冷凍，本次試驗(yàn)采用細(xì)管冷凍法進(jìn)行冷凍。

1.2 稀釋液的配制?；A(chǔ)稀釋液配方為：Tris27.1g/L，檸檬酸14.0 g/L，果糖10 g/L，卵黃20%(V/V)，甘油4%(V/V)，pH值6.8。青霉素、鏈霉素各100萬(wàn)單位/L。在基礎(chǔ)稀釋液配方基礎(chǔ)上設(shè)置了5個(gè)半胱氨酸梯度：0 mmol/L、2.5 mmol/L、5 mmol/L、7.5 mmol/L和10 mmol/L。

1.3 精液稀釋與細(xì)管冷凍精液制作(全套法國(guó)卡蘇公司進(jìn)口的細(xì)管精液冷凍設(shè)備)。將檢驗(yàn)合格的精液混合在一起，按照試驗(yàn)組數(shù)，平均分開，隨后在37℃下用配好的稀釋液分別進(jìn)行10倍稀釋，0.25 ml細(xì)管灌裝，4℃低溫平衡，程序冷凍儀冷凍，最后液氮罐保存。

1.4 精液解凍。從液氮罐中取出精液細(xì)管，迅速浸入39℃～40℃水浴鍋中，輕輕搖動(dòng)直至融化(15 s)。

1.5 精液品質(zhì)測(cè)定。顯微鏡鏡檢精液活率、畸形率、頂體完整率和質(zhì)膜完整率。精子活率=(呈直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)/精子總數(shù))×100%；畸形率=(畸形精子數(shù)/精子總數(shù))×100%；頂體完整率=(頂體完整精子數(shù)/精子總數(shù))×100%；質(zhì)膜完整率=(尾部膨脹數(shù)/全部精子數(shù))×100%；生存指數(shù)：將相鄰兩次檢查的平均活率與間隔時(shí)間的積相加總和為生存指數(shù)。脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和抗氧化酶的測(cè)定：采用南京建成生物科技公司生產(chǎn)的試劑盒檢測(cè)精漿中相關(guān)抗氧化酶(MDA、SOD、GSH-PX、CAT、GSH)的活力。嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行試驗(yàn)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。用SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，單因變量多因素方差分析和Duncan法多重比較統(tǒng)計(jì)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋液中添加半胱氨酸對(duì)解凍后精液品質(zhì)的影響。根據(jù)表1可知，從解凍后精子活率來(lái)看，添加7.5 mmol/L半胱氨酸組精子的解凍后活率顯著高于其它組(P＜0.05)，從解凍后精子畸形率來(lái)看，添加7.5 mmol/L半胱氨酸組精子的解凍后畸形率顯著低于其它組(P＜0.05)。從解凍后頂體完整率來(lái)看，添加7.5 mmol/L半胱氨酸組精子的解凍后頂體完整率顯著高于其它組(P＜0.05)。從解凍后質(zhì)膜完整率來(lái)看，各組之間差異不顯著(P＞0.05)。從解凍后的生存指數(shù)來(lái)看，添加7.5 mmol/L半胱氨酸組精子的解凍后生存指數(shù)顯著高于其它組(P＜0.05)。

表1 稀釋液中添加半胱氨酸對(duì)解凍后精液品質(zhì)的影響

2.2 稀釋液中添加半胱氨酸對(duì)解凍后精液脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和抗氧化酶活性的影響。根據(jù)表2可知，在稀釋液中添加半胱氨酸對(duì)解凍后精液中SOD、GSH-PX的活性和GSH的含量沒有明顯影響，各組之間差異不顯著(P＞0.05)。添加7.5 mmol/L半胱氨酸組解凍后精液中MDA的濃度顯著低于其它組(P＜0.05)，CAT的活性顯著高于其它組(P＜0.05)。

表2 稀釋液中添加半胱氨酸對(duì)解凍后精液脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和抗氧化酶活性的影響

3 結(jié)論與討論

在精液冷凍過程中，分別比較不同濃度梯度半胱氨酸對(duì)冷凍精液品質(zhì)的影響，結(jié)果顯示：以在稀釋液中添加7.5 mmol/L半胱氨酸對(duì)冷凍精液品質(zhì)的保護(hù)效果最好。

在稀釋液中添加7.5 mmol/L半胱氨酸后，冷凍精液解凍后活率有顯著的提高。Funahashi[4]等添加半胱氨酸在豬精液中，能顯著提高精子的活率和頂體完整率。在本試驗(yàn)中添加半胱氨酸后，冷凍精液解凍的精子畸形率顯著降低，頂體完整率有顯著的提高，和以往的研究基本一致。

低溫保存過程影響著精子細(xì)胞，在冷凍期間或凍融之后增加了活性氧的產(chǎn)生或是減少了抗氧化劑含量水平。解凍后，在稀釋液中加入抗氧化劑能降低精子細(xì)胞膜開始脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。體細(xì)胞中抗氧化作用是通過細(xì)胞質(zhì)中的酶，如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽氧化酶來(lái)實(shí)現(xiàn)的。而精子細(xì)胞在成熟后細(xì)胞質(zhì)大量流失，從而失去了一些保護(hù)作用[5]。在精漿中非酶性抗氧化劑(抗壞血酸、α-生育酚、?；撬?、谷胱甘肽和白蛋白)是精子防御活性氧最重要的物質(zhì)。谷胱甘肽在精漿中濃度相對(duì)較高，由于谷胱甘肽含有巰基，巰基可直接與過氧化氫、超氧化物陰離子、羥自由基、氫過氧化物和烷氧基反應(yīng)[5]，其在細(xì)胞抗氧化防御中有重要的作用。其它含有巰基的化合物(半胱氨酸、麥角硫因)在維護(hù)精子活率和代謝功能方面也有重要的作用[6]。半胱氨酸是含有巰基的氨基酸，半胱氨酸是細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽生物合成的前體[7]。本試驗(yàn)表明，在稀釋液中添加半胱氨酸后，解凍后精液中MDA濃度顯著降低，CAT的活性顯著提高。表明半胱氨酸在抗氧化作用和防止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)方面有很好的作用。