雷帕霉素對(duì)三角褐指藻巖藻黃素含量及關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響

韋鳳娟，龔一富，章 麗，陳榮實(shí)，王何瑜，楊冰迪

(1.寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，寧波 315832；2.寧波大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院，寧波 315832)

三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)中含有巖藻黃素(Fucoxanthin)等光輔助合成色素，是生產(chǎn)高品質(zhì)巖藻黃素的潛在資源[1]。巖藻黃素具有抗癌、抗炎、減肥、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)血糖、提高免疫力等多種生物學(xué)功能[2-7]。但巖藻黃素產(chǎn)量低，市場(chǎng)對(duì)巖藻黃素需求較大，如何提高巖藻黃素產(chǎn)量是目前國內(nèi)外研究者的關(guān)注焦點(diǎn)。前人使用硫酸鈰銨、乙酰水楊酸、花生四烯酸、光質(zhì)等不同誘導(dǎo)子和培養(yǎng)條件提高三角褐指藻巖藻黃素含量[8-11]，但要實(shí)現(xiàn)巖藻黃素的商業(yè)化生產(chǎn)，還需要篩選更多提高巖藻黃素含量的誘導(dǎo)子。

雷帕霉素(Rapamycin，RPM)是從復(fù)活節(jié)島的土壤吸濕鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)中分離的一種免疫抑制性大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[12]。雷帕霉素靶蛋白(Target of Rapamycin，TOR)可使40S核糖體蛋白S6激酶(S6K)磷酸化，并通過調(diào)節(jié)不敏感的油菜素類固醇-2(BR INSENSITIVE 2)促進(jìn)葉綠體的產(chǎn)生和幼苗生長[13]。過表達(dá)擬南芥(Arabidopsisthaliana)TOR有利于促進(jìn)生長[14]。RPM可使牡丹(Paeoniasuffruticosa)衰老延遲、切花保鮮期延長[15]。在藻類次生代謝調(diào)節(jié)的研究中，RPM促進(jìn)萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)甘油三酯(triacylglycerol，TAG)含量積累[16-17]，目前RPM對(duì)三角褐指藻次生代謝產(chǎn)物含量影響及機(jī)理的研究尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)研究RPM對(duì)三角褐指藻巖藻黃素含量的影響，將擴(kuò)大RPM在藻類次生代謝調(diào)控方面的應(yīng)用。

巖藻黃素合成途徑已基本清楚，八氫番茄紅素脫氫酶基因(pds)和番茄紅素β-環(huán)化酶基因(lcyb)是巖藻黃素生物合成下游途徑中的關(guān)鍵酶，其基因表達(dá)與巖藻黃素合成息息相關(guān)[9-11]，且pds和lcyb基因?qū)r藻黃素積累貢獻(xiàn)率最高[9]。前人研究還表明，巖藻黃素含量與光合作用相關(guān)[11,18]，光系統(tǒng)II蛋白D1基因(psbA)、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶大亞基基因(rbcL)、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基基因(rbcS)是參與光系統(tǒng)II、決定碳同化速率和植物光呼吸的關(guān)鍵酶，光合抑制劑(DCMU)抑制psbA和rbcL基因的表達(dá)，通過抑制光合作用效率從而抑制巖藻黃素的積累[18]。水楊酸處理大豆后rbcS基因表達(dá)上升[19]，巖藻黃素在植物體內(nèi)與葉綠素a集合形成蛋白復(fù)合體(FCP)參與光合作用[20]。但RPM是否通過合成途徑相關(guān)酶基因表達(dá)調(diào)控巖藻黃素的合成，或光合作用相關(guān)酶基因表達(dá)調(diào)控，又或二者共同參與，均未見相關(guān)報(bào)道。因此，實(shí)驗(yàn)通過RPM對(duì)三角褐指藻巖藻黃素含量變化影響，以及對(duì)巖藻黃素生物合成基因pds、lcyb和光合作用相關(guān)基因psbA、rbcL、rbcS、fcpb表達(dá)數(shù)據(jù)分析，為研究RPM對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物調(diào)控提供前期基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

三角褐指藻藻種由寧波大學(xué)海洋學(xué)院藻類實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)提供，藻液體培養(yǎng)基由天然海水過濾高溫滅菌，加入1∶1 000比例滅菌MAV母液[21]備用，藻固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加1.2%的瓊脂滅菌備用。藻種在固體培養(yǎng)基純化后加入液體培養(yǎng)基擴(kuò)繁。

1.2 方法

1.2.1 三角褐指藻的培養(yǎng)及RPM濃度設(shè)置

天然海水過濾后高溫滅菌，添加1∶1 000滅菌MAV母液制備三角褐指藻培養(yǎng)基，以1∶10比例接入無菌原藻液擴(kuò)繁培養(yǎng)，藻液置于20 ℃± 1 ℃，12 h/12 h(黑暗/光照)62.5 μmol photons/(m2·s)培養(yǎng)7 d至對(duì)數(shù)生長期。RPM(上海阿拉丁生化試劑有限公司)溶于無菌水，微量乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)助溶。0、2.5、5、7.5和10 mmol/L 5個(gè)水平的RPM質(zhì)量濃度，加入三角褐指藻藻液中，共3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 三角褐指藻生長曲線測(cè)定

三角褐指藻標(biāo)準(zhǔn)生長曲線參考徐潤潔等[11]測(cè)定方法。藻液加入RPM后每間隔24 h定時(shí)取藻液用紫外分光光度計(jì)(UV-5200，上海元析儀器有限公司)測(cè)定藻液OD680數(shù)值，3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)生長曲線公式換算各RPM處理組藻細(xì)胞數(shù)作生長曲線。

1.2.3 三角褐指藻葉綠素a含量測(cè)定

量取平臺(tái)末期藻液30 mL，在4 ℃、5 000 r/min離心10 min，棄上清液，藻泥用蒸餾水2次洗滌，1 mL無水乙醇混勻藻泥，避光靜置24 h，測(cè)量靜提液A649、A665處吸光值，計(jì)算葉綠素a含量[22]。

Chl a(mg/L)=13.95 ×A665-6.88 ×A649

(1)

1.2.4 巖藻黃素含量的測(cè)定

收集各RPM組藻細(xì)胞，提取巖藻黃素和測(cè)定含量[23-24]，3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。量取90 mL藻液，4 ℃ 5 000 r/min離心10 min，棄上清液，藻泥-80℃凍存10 h，冷凍干燥48 h，凍干藻泥稱重研磨成粉末，約0.1 g。加入1 mL無水乙醇充分混勻，60 ℃避光浸提1 h，2次。4 ℃ 5 000 r/min離心10 min，取上清液，測(cè)定提取液A445，計(jì)算巖藻黃素含量。

巖藻黃素含量(mg/g DW)=

(2)

1.2.5 RT-QPCR測(cè)定巖藻黃素生物合成及光合作用相關(guān)基因表達(dá)分析

RPM處理對(duì)數(shù)生長期三角褐指藻24 h，量取藻液90 mL在4 ℃ 5 000 r/min離心10 min，棄上清液，總RNA提取按Plant RNA Kit試劑盒說明書，總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA使用Takara Prime Script RT Reagent Kit試劑盒。

三角褐指藻巖藻黃素生物合成代謝通路相關(guān)核心序列和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果從NCBI下載[9]，選出巖藻黃素合成關(guān)鍵酶基因pds和lcyb序列，光合作用相關(guān)基因psbA、rbcL、rbcS和fcpb序列。引物設(shè)計(jì)應(yīng)用Primer Primer 5.0軟件(表1)，上海生工生物工程公司合成，模板cDNA為RPM處理組cDNA。SYBR 10 μL、上游引物0.8 μL、下游引物0.8 μL、超純水6.4 μL、模板2 μL，共20 μL為PCR反應(yīng)體系。程序在Mastercycler ep realplex實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Eppendorf，German)進(jìn)行，擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min?；蛳鄬?duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法[25]計(jì)算得出。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用Mircosoft Excel 2019對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、Origin 7.0作圖，采用SPSS22.0進(jìn)行顯著性分析。將RPM處理三角褐指藻巖藻黃素生物合成及光合作用相關(guān)的6個(gè)基因和葉綠素a含量作為指標(biāo)，與巖藻黃素含量作相關(guān)性分析和主成分分析(PCA)。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，提取主成分的特征值/方差，然后提取每個(gè)變量的特征值，繪制變量和相關(guān)曲線。通過PCA分析，找到對(duì)主成分重要的變量，消除嘈雜的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度RPM對(duì)三角褐指藻藻細(xì)胞生長的影響

RPM對(duì)三角褐指藻細(xì)胞生長變化結(jié)果表明(圖1)，RPM處理后1～2 d藻細(xì)胞數(shù)增長速率均比對(duì)照組(0 mmol/L)快，第3天藻細(xì)胞數(shù)總體下降，第4～5天藻細(xì)胞數(shù)保持上升，其中5 mmol/L RPM處理組藻細(xì)胞數(shù)增加得最多。

圖1 RPM對(duì)三角褐指藻細(xì)胞生長的影響

2.2 RPM對(duì)三角褐指藻葉綠素a含量的影響

RPM對(duì)三角褐指藻葉綠素a含量變化結(jié)果表明(圖2)，7.5 mmol/L RPM處理組的三角褐指藻葉綠素a含量比對(duì)照組(0 mmol/L)高，表明7.5 mmol/L RPM可促進(jìn)三角褐指藻光合作用及色素積累。其他濃度處理組的葉綠素a含量下降，2.5 mmol/L和10 mmol/L RPM對(duì)三角褐指藻葉綠素a抑制明顯(P<0.01)。

** 為P<0.01。

2.3 RPM對(duì)三角褐指藻巖藻黃素含量的影響

RPM對(duì)三角褐指藻巖藻黃素含量的影響結(jié)果表明[圖3(a)]，RPM處理組三角褐指藻巖藻黃素含量均高于對(duì)照組(0 mmol/L)(P<0.01)，其中5 mmol/L和2.5 mmol/LRPM處理組的三角褐指藻巖藻黃素含量都提高了40%。RPM處理對(duì)單位藻細(xì)胞巖藻黃素含量的影響結(jié)果表明[圖3(b)]，RPM處理單位藻細(xì)胞巖藻黃素含量變化跟總巖藻黃素含量變化趨勢(shì)基本一致，2.5 mmol/L和5 mmol/L RPM處理組三角褐指藻巖藻黃素含量提高31%(P<0.01)，表明RPM處理對(duì)三角褐指藻巖藻黃素含量積累具有促進(jìn)作用。

** 為P<0.01。

2.4 RPM對(duì)三角褐指藻巖藻黃素生物合成及光合作用相關(guān)基因表達(dá)影響

RT-qPCR研究結(jié)果表明(圖4)，RPM處理組巖藻黃素合成途徑貢獻(xiàn)率最高的基因是pds和lcyb，在7.5 mmol/L和10 mmol/L處理組pds的表達(dá)量均高于對(duì)照組(P<0.01)，5 mmol/L處理組pds表達(dá)量低于對(duì)照組。lcyb基因表達(dá)量在RPM處理組中均低于對(duì)照組。psbA、rbcL和rbcS3個(gè)光合作用相關(guān)基因在5 mmol/L RPM處理組表達(dá)均上調(diào)(P<0.01)，fcpb基因則在7.5 mmol/L和10 mmol/L處理組表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，即RPM可促進(jìn)合成途徑基因pds及光合基因psbA、rbcL、rbcS和fcpb轉(zhuǎn)錄表達(dá)。RPM處理組基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)與巖藻黃素含量結(jié)果趨勢(shì)稍有差異，說明巖藻黃素合成途徑相關(guān)基因和光合作用相關(guān)基因共同參與巖藻黃素生物合成。

** 為P<0.01。

2.5 三角褐指藻巖藻黃素含量積累因子的主成分分析

主成分分析結(jié)果表明(表2)，PC1、PC2和PC3的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)91.9%。相關(guān)性分析表明(圖5)，前3個(gè)主成分均包含有rbcS、psbA和rbcL基因，均是光合作用相關(guān)基因，而巖藻黃素合成基因?qū)r藻黃素積累貢獻(xiàn)率不高，說明光合作用rbcS、psbA和rbcL基因轉(zhuǎn)錄是影響三角褐指藻巖藻黃素積累的最重要因子。

表2 8個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率和累積貢獻(xiàn)率

圖5 巖藻黃素生物合成基因、光合作用相關(guān)基因與其含量的主成分分析

3 討論與結(jié)論

施加誘導(dǎo)劑處理藻類，藻類育種、生長形態(tài)和生物量的積累有一定改變，RPM在調(diào)節(jié)代謝、翻譯和轉(zhuǎn)錄中具有關(guān)鍵作用，通過下游靶標(biāo)TOR的磷酸化控制細(xì)胞增殖、發(fā)育和生長[26-27]，RPM復(fù)合物可調(diào)控營養(yǎng)物質(zhì)、光和能量而促進(jìn)植物生長[28-29]。研究結(jié)果表明，RPM處理三角褐指藻前期促進(jìn)藻細(xì)胞生長，后期抑制藻細(xì)胞生長。7.5 mmol/L RPM促進(jìn)葉綠素a含量，葉綠素a主要參與光合作用，在光合植物中將光能傳遞給光合電子傳遞鏈(PETC)并在其上轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，植物細(xì)胞感光強(qiáng)度和PETC工作速率取決于受鹽度、pH值、溫度和營養(yǎng)成分等影響的細(xì)胞代謝環(huán)境[30]，故植物受到外界因子刺激伴隨一系列反應(yīng)促進(jìn)光合作用。光合系統(tǒng)能量過剩時(shí)，激發(fā)態(tài)葉綠素a將能量傳遞給其他分子轉(zhuǎn)化為熱量[31]，葉綠素a含量消耗，可能是光合系統(tǒng)葉綠素a含量下降原因之一。RPM處理組三角褐指藻巖藻黃素含量和單位藻細(xì)胞巖藻黃素含量均上升(P<0.01)，5 mmol/L RPM處理組含量上升最高。光合作用輔助色素中類胡蘿卜素在植物類囊體中捕獲光照和傳遞能量，巖藻黃素與葉綠素a結(jié)合形成巖藻黃素-葉綠素蛋白復(fù)合體(FCP)作為主要類胡蘿卜素參與光合作用[20]，在植物內(nèi)起到快速的光保護(hù)作用，消耗過剩能量[31]。葉綠素a消耗促進(jìn)光合作用可能是促進(jìn)巖藻黃素含量上升因素之一。

研究中巖藻黃素生物合成基因pds和lcyb，光合作用相關(guān)基因psbA、rbcL、rbcS和fcpb的表達(dá)水平與巖藻黃素含量存在正相關(guān)性，rbcS對(duì)巖藻黃素合成促進(jìn)作用明顯。賀超英等[19]發(fā)現(xiàn)大豆中rbcS基因表達(dá)量在NaCl和水楊酸處理24 h后出現(xiàn)高峰。植物中促進(jìn)rbcS基因的表達(dá)具有明顯的葉組織特異性和光誘導(dǎo)特異性[32]，可提高植物光合效率[33]。DCMU處理三角褐指藻，藻細(xì)胞巖藻黃素含量結(jié)果[18]與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，證明光合作用對(duì)巖藻黃素積累具有促進(jìn)作用。光合作用是植物生產(chǎn)物質(zhì)量的基礎(chǔ)條件，rbcL和rbcS作為Rubisco酶亞基基因可調(diào)節(jié)酶活直接影響大豆光合效率[34]，據(jù)基因轉(zhuǎn)錄水平推測(cè)rbcL和rbcS通過提高藻光合效率促進(jìn)巖藻黃素含量上升目的；psbA是psⅡ光反應(yīng)中心D1(32 ku)蛋白的基因，D1蛋白作為psⅡ電子受體參與光誘導(dǎo)的電子傳遞[35]，D1蛋白和Rubisco酶在電子傳遞鏈上下游，5 mmol/L RPM處理下藻細(xì)胞增量最多，說明電子傳遞速率高，psbA基因表達(dá)水平上調(diào)，其他處理組未顯著變化，推測(cè)高濃度RPM可能會(huì)阻斷電子鏈傳遞；在褐藻中主要收集光的葉黃素是巖藻聚糖，巖藻聚糖復(fù)合物包含約相同量的巖藻黃素和葉綠素，高濃度RPM處理組fcpb轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)上調(diào)表明在電子傳遞鏈?zhǔn)茏璧揭欢ㄅR界時(shí)，藻內(nèi)環(huán)境可能會(huì)自我調(diào)節(jié)，適應(yīng)外界環(huán)境脅迫，呈現(xiàn)負(fù)反饋調(diào)節(jié)。合成巖藻黃素后兩步的催化反應(yīng)與光照條件有關(guān)[36]，這也說明光照、光合作用都影響巖藻黃素的積累。徐潤潔等[11]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。巖藻黃素合成途徑貢獻(xiàn)率最高的pds和lcyb表達(dá)水平未隨著RPM濃度呈線性關(guān)系，從另一角度說明巖藻黃素合成過程并不僅僅只有生物合成關(guān)鍵酶基因參與了，光合作用也扮演著重要角色。在RPM處理下的藻細(xì)胞如何通過自我調(diào)節(jié)完成巖藻黃素生物量積累過程，還有待探索和研究。