替代動物的實驗倫理規(guī)范研究進展

魏 欣，徐維平

(1.中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院智能機械研究所，合肥 230031；2.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)研究生院科學(xué)島分院，合肥 230026；3.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院，合肥 230001)

加強科學(xué)研究過程中實驗設(shè)計的科學(xué)性以及對動物給予人道主義關(guān)懷和福利，加快替代動物實驗的廣泛實施，實現(xiàn)對替代動物倫理委員會替代方案評估的指導(dǎo)，規(guī)范替代動物倫理委員會的審查工作，切實保護實驗動物的權(quán)益是推進動物實驗改革的重要內(nèi)容。嚴格遵守《動物倫理學(xué)》3R原則，即實驗動物的替代(replacement)、減少(reduction)和優(yōu)化(refinement)，向社會倡導(dǎo)科學(xué)、人道地開展動物實驗是科學(xué)研究始終堅守的宗旨。替代是使用低等動物代替高等動物，或不使用動物而采用其他方法達到與動物實驗相同的目的[1]；減少是使用較少量的動物獲取同樣多的實驗數(shù)據(jù)或使用一定數(shù)量的動物獲得更多的實驗數(shù)據(jù)[2]；優(yōu)化是對必須使用的實驗動物，應(yīng)盡量減低非人道方法的使用頻率或危害程度[3]。隨著時代的進步，Russell和Burch在3R原則的基礎(chǔ)上提出了4Rs原則，強調(diào)在實驗過程中要不斷增強倫理觀念，對實驗動物要有責(zé)任感(responsibility)[4]。

隨著實驗動物質(zhì)量要求和控制級別越來越高以保證實驗結(jié)果的均一性和重復(fù)性，以及受到動物福利和動物保護主義思想的影響，人們更加傾向于把握實驗動物福利原則、遵循實驗動物福利法規(guī)、嚴格履行動物實驗倫理審查制度。但針對高校師生、醫(yī)務(wù)工作者和實驗動物從業(yè)人員關(guān)于動物福利倫理認知情況的調(diào)查結(jié)果顯示，對動物福利倫理管理法規(guī)和動物福利概念，大多數(shù)人沒有清晰的認識和了解，這種現(xiàn)象說明我國關(guān)于動物福利教育的普及亟待進一步加強[5]。3R原則在近代動物實驗研究發(fā)展中是始終貫穿的核心思想，它試圖通過其他實驗手段代替動物實驗或用離體培養(yǎng)的細胞、組織、器官等半替代動物實驗減少動物的使用，這在單克隆抗體的生產(chǎn)、病毒疫苗的制備、效力和安全性實驗、細胞膜研究等項目中已廣泛應(yīng)用。通過使用低等生物如用果蠅代替小鼠研究致畸致突變[6]；用海洋無脊椎動物代替蟾蜍和犬研究神經(jīng)生理學(xué)[7-8]；用微生物代替動物進行艾母式試驗(ames test)[9]；用物理方法代替動物研究心肺復(fù)蘇等病理過程；用免疫化學(xué)方法代替動物來搜尋抗原或鑒定毒素的存在。此外，計算機模擬在替代動物實驗的應(yīng)用中已初見曙光，計算機毒理學(xué)在新藥毒性研究應(yīng)用中具有前景。國外實驗室還通過使用光纖、導(dǎo)管、激光等遠程控制，盡量減少對動物的刺激，避免應(yīng)激反應(yīng)提高實驗的準確性[10]。替代動物方法和模型取得了長足進展。然而，關(guān)于替代動物實驗的倫理規(guī)范目前國家尚無明確法規(guī)出臺，現(xiàn)就替代動物實驗倫理相關(guān)進展進行綜述。

1 替代動物實驗研究倫理規(guī)范化的必要性

1.1 實驗動物使用持續(xù)增長

針對實驗動物使用數(shù)量的調(diào)查結(jié)果顯示，我國2016—2018年間的新藥研發(fā)使用的實驗動物數(shù)量呈平穩(wěn)增長趨勢[11]。2008年至2017年期間，土耳其共有約210萬只動物被用于實驗和其他科學(xué)研究目的[12]。土耳其管理動物使用的法律結(jié)構(gòu)與歐盟的法律結(jié)構(gòu)是一致的。1995年至2011年間，歐盟國家用于科學(xué)研究目的的動物總數(shù)量(每年約1 100萬只)保持相對穩(wěn)定，德國和英國的凈數(shù)量在增加，比利時、丹麥、意大利、芬蘭、荷蘭和瑞典的凈數(shù)量在減少。在實驗動物用途分類上，用于安全性評估的實驗動物數(shù)量相對較低(其中毒理學(xué)為8%)，這可能是由于在這一領(lǐng)域?qū)μ娲椒ㄟM行了特別密集的研究導(dǎo)致實驗動物使用減少[13]。在總量上，有研究對2015年全球使用的實驗動物數(shù)量進行了估計，2015年用于科學(xué)目的的動物數(shù)量全球總數(shù)為1.921億只，比2005年統(tǒng)計數(shù)量增加36.9%[14]。這一數(shù)字包括因其組織有用而被處死的動物、用于維持轉(zhuǎn)基因菌株的正常動物和沒有有害基因突變的轉(zhuǎn)基因動物，以及為實驗室用途而飼養(yǎng)但未使用的動物。由此可見，控制實驗動物的使用數(shù)量，積極尋找替代方案是全球共同致力的心愿。

1.2 動物實驗倫理規(guī)范欠缺

雖然實驗動物模型在科學(xué)研究中具有非常多的優(yōu)越性，然而動物實驗倫理的規(guī)范化目前還存在缺陷。研究顯示，無論是科學(xué)研究設(shè)計[15]、醫(yī)學(xué)教學(xué)過程[16]，還是期刊論文發(fā)表要求中動物實驗的倫理審查都還存在大量不規(guī)范的問題[17]。動物實驗符合倫理要求一方面是人道主義的體現(xiàn)，另一方面是保障實驗結(jié)果可靠、可重復(fù)的重要前提。目前動物實驗倫理缺陷主要體現(xiàn)在動物實驗倫理學(xué)認識不足、試驗過程中缺乏對動物倫理的思考，國內(nèi)學(xué)術(shù)期刊對實驗動物倫理的要求有待提高，實驗動物倫理審查委員會建設(shè)有待規(guī)范，實驗動物機構(gòu)資質(zhì)認證有待加強，實驗過程對動物的麻醉、取材和處死過程有待優(yōu)化等[18-19]。

雖然人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)動物實驗暴露的倫理問題，但動物實驗倫理規(guī)范化進展緩慢，并且不同國家的法律法規(guī)跟進程度和速度差異巨大，難以在短期內(nèi)對現(xiàn)狀實現(xiàn)較大的改善。因此，使用低等生物替代高等生物，使用非生物替代生物的替代動物研究方法成為研究者的希望所在。替代動物在很多方面避免了倫理審查問題，采用其他手段減少動物的使用或不使用動物進行科學(xué)研究，因此規(guī)范化更加容易實現(xiàn)，在近年來得以快速發(fā)展。

2 替代動物研究倫理規(guī)范評估的范圍

“替代”是3R原則的核心內(nèi)容之一。替代動物實驗的基本范圍主要包括3個層次：(1)應(yīng)用體外實驗替代整體動物實驗，如體外培養(yǎng)的動物或人原代細胞、組織標本、類器官和細胞系等；(2)應(yīng)用低等生物和有限知覺的生物體替代脊椎動物實驗，如植物、細菌、果蠅和斑馬魚等；(3)應(yīng)用數(shù)學(xué)、物理和化學(xué)方法以及計算機模型等非生物手段，如利用構(gòu)效關(guān)系(structure-activity relationships，SARs)模型預(yù)測化合物的潛在生物學(xué)效應(yīng)[20]。替代方法主要研究內(nèi)容包括:毒理學(xué)檢測、化妝品毒性檢測、眼刺激試驗替代方法;動物模型替代，以體外細胞實驗代替整體動物實驗；藥物代謝反應(yīng)和動物實驗教學(xué)等。

2.1 毒理學(xué)檢測、化妝品毒性檢測、眼刺激試驗替代方法

替代動物毒理學(xué)檢測范圍包括急性經(jīng)口毒性試驗、急性吸入毒性試驗、皮膚腐蝕試驗、皮膚刺激試驗、經(jīng)皮膚吸收試驗、眼刺激試驗、皮膚過敏試驗、光毒性試驗、內(nèi)分泌干擾試驗、胚胎毒性試驗、血液毒性試驗、遺傳毒性[10]。當前國家已發(fā)布的替代方法標準幾乎全部涉及化妝品毒性研究，如化妝品體外替代試驗實驗室規(guī)范(SN/T 2285—2009)、化妝品急性毒性的角質(zhì)細胞試驗(SN/T 2328—2009)、防曬化妝品紫外線A(UVA)光防護效果體外測定方法(SN/T 5150—2019)等[21]。目前根據(jù)使用材料和作用原理的不同，眼刺激試驗替代方法可分為7類：(1)嚴重眼損傷和眼刺激性的體外綜合測試評估方法；(2)牛角膜渾濁和滲透性試驗細胞膜損傷試驗；(3)離體雞眼試驗；(4)短時暴露試驗；(5)重組人角膜上皮模型試驗；(6)熒光素滲漏試驗；(7)其他替代試驗方法(如體外細胞試驗方法、微生理儀細胞傳感器試驗等)[22]。

2.2 動物模型替代

科學(xué)研究在探索現(xiàn)象和真理的同時也會使動物造成超出研究范圍的傷害，因此科學(xué)家一直在不斷探索減少動物在研究模型中的使用，或使用非生物體模型進行替代研究從而避免動物的使用。例如，在皮膚抗氧化功效評價模型的使用中，從最初使用大鼠模型進行紫外線照射等研究[23]，發(fā)展到使用動物離體皮膚模型[24]、Episkin模型及Phenion和EpiDermTM等商用全層皮膚模型[25-27]。這避免了動物在實驗過程中造成的皮膚損傷和全身系統(tǒng)反應(yīng)。類似的，在神經(jīng)發(fā)育毒性動物實驗研究中，由于毒性化合物的數(shù)量巨大，采用哺乳動物進行神經(jīng)毒性研究在經(jīng)濟上和動物使用數(shù)量上都是巨大負擔(dān)，因此采用體外細胞模型模擬神經(jīng)發(fā)育過程中的關(guān)鍵事件，進行化合物的神經(jīng)毒性測定[28-30]。由于神經(jīng)系統(tǒng)交錯影響的復(fù)雜性，為了彌補體外細胞模型的局限性，還采用了非哺乳動物模型進行系統(tǒng)研究，如斑馬魚、線蟲和果蠅等已廣泛用于神經(jīng)發(fā)育機制的研究[31]。

2.3 藥物代謝反應(yīng)和動物實驗教學(xué)替代研究

2.3.1 藥物代謝反應(yīng)體外模擬

計算機模擬在藥物代謝反應(yīng)替代研究中發(fā)揮重要作用，尤其是基于生理的生物動力學(xué)(physiologically-based biokinetic，PBBK)模擬計算工具可以用來預(yù)測化妝品的毒性和藥物的吸收、分布、代謝、排泄特征[32]。此外，計算機模擬還常常被用來在細節(jié)上模擬蛋白質(zhì)、受體、脂質(zhì)雙分子層、血腦屏障等預(yù)測他們對物理條件和刺激或化學(xué)物質(zhì)的行為或反應(yīng)。計算機模擬和信息學(xué)方法通過預(yù)先篩選潛在的藥物候選分子，排除成藥可能性較小的化合物從而使藥物發(fā)現(xiàn)過程縮短以及犧牲的實驗動物數(shù)量最小化，此外還避免了倫理問題。用基于計算機的替代動物實驗室的比例在西班牙最高(73%)，而在法國和意大利則較低。波蘭、捷克共和國和羅馬尼亞報告了相對較高的計算機化替代試驗使用率。意大利(64%)和荷蘭(67%)最大限度地利用免費的計算機資源。西班牙(27%)、德國(41%)和荷蘭(22%)等國家最大限度地利用了內(nèi)部開發(fā)的計算機模擬資源[33]。

2.3.2 實驗教學(xué)替代研究

高校教學(xué)是實驗動物使用的重要組成部分，關(guān)于動物實驗教學(xué)過程中的替代研究已有一些共識。教學(xué)中使用的動物數(shù)量約占使用動物總數(shù)的1%到10%[34]。人們呼吁通過使用人體生理學(xué)實驗代替部分動物教學(xué)，或通過合并實驗內(nèi)容最大程度減少教學(xué)過程中動物的使用，強化學(xué)生的動物倫理觀念，尊重和保障動物福利。此外，還可以通過增加計算機模擬和視頻教學(xué)增強學(xué)生操作技能，防止教學(xué)過程中因操作原因增加動物不必要的傷害[35]。實踐表明，使用多元化的方式進行動物實驗教學(xué)并不會影響實驗教學(xué)的效果，反而激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣[2]。計算機模擬和視頻教學(xué)也方便學(xué)生在課后反復(fù)練習(xí)，鞏固了教學(xué)成果。

3 替代動物研究倫理規(guī)范評估指導(dǎo)原則

人源的細胞和組織在疾病和治療相關(guān)研究中具有獨特的優(yōu)越性，更加貼近真實疾病狀態(tài)，因此深受研究者的青睞。雖然替代動物實驗通過選擇細胞、人體組織或低等生物及計算模型代替研究在一定程度上減少了傳統(tǒng)實驗動物的使用，然而關(guān)于替代動物實驗中的倫理審查規(guī)范還不十分明確?！叭祟惢蚓庉媼雰骸笔录翘娲鷦游飳嶒瀭惱聿灰?guī)范的典型案例[36]，該事件造成了嚴重的社會影響并引發(fā)全社會范圍對科學(xué)研究過程中倫理問題的關(guān)注與擔(dān)憂。通常公眾輿論只有在有助于開發(fā)更好的藥物或增加對疾病的了解時才會支持動物研究，進而促進有效的預(yù)防方法或?qū)勾祟惣膊〉男滤幈话l(fā)現(xiàn)[37]。因此，在采用替代動物方法進行研究時必須嚴格遵守相關(guān)倫理規(guī)范。3R原則和5項自由原則(即免于饑渴、不適、痛苦、傷害和疾病、恐懼和焦慮的自由，自由表達天性)同樣適用于替代動物實驗。對低等動物和無脊椎動物替代研究實驗，要遵守實驗動物倫理原則，尊重動物生命和權(quán)益，遵守人類社會公德。堅決反對針對動物的野蠻和不人道的行為。對非生物類型的研究，如計算機模擬等的研究，要充分保證替代方法驗證有效，以保證藥物開發(fā)的成功率及臨床試驗的有效性。

4 替代動物研究倫理規(guī)范實施后追蹤

為了對替代動物研究倫理規(guī)范實施效果進行評估，各級倫理委員會應(yīng)對特定的實驗進展進行倫理追蹤，不斷強化替代動物實驗的監(jiān)管，保證實施與方案的一致性。對實施過程中的方案變更要及時嚴格進行補充審查，防止變更過程中有不符合倫理規(guī)范的操作。

4.1 對減少或優(yōu)化的動物實驗研究

所謂實驗動物的福利倫理審查，就是按照實驗動物福利倫理的原則和標準，對使用實驗動物的必要性、合理性和規(guī)范性進行專門的檢查和審定。實驗動物(福利)倫理委員會是可獨立開展實驗動物福利倫理審查工作的專門組織，負責(zé)實驗開展前、實驗過程中及實驗結(jié)束后對實驗過程中動物福利和倫理規(guī)范進行審查和評估。倫理委員會由本級實驗動物主管機構(gòu)或從業(yè)單位負責(zé)組建；可根據(jù)實驗動物有關(guān)法律、規(guī)定和質(zhì)量技術(shù)標準，負責(zé)各自管理權(quán)限范圍內(nèi)實驗動物從業(yè)單位的實驗動物相關(guān)的福利倫理審查和監(jiān)督，受理相關(guān)的舉報和投訴[38]。

4.2 對教學(xué)過程中動物實驗研究

為規(guī)范醫(yī)學(xué)及獸醫(yī)學(xué)教學(xué)過程中的動物倫理審查，院校教學(xué)使用的動物應(yīng)向?qū)W校動物倫理委員會報備，教師按照要求提交倫理審查批準書。授課教師應(yīng)詳細記錄教學(xué)內(nèi)容和動物處理過程、處理結(jié)果。每次教學(xué)結(jié)束應(yīng)及時提交當次實驗報告給動物倫理委員會備查，倫理委員會及時審查并給出相應(yīng)意見進行教學(xué)改進[39]。若教學(xué)過程中發(fā)生突發(fā)事件導(dǎo)致動物意外死亡或因其他原因?qū)е碌膶嶒瀯游镌黾拥那闆r，教師應(yīng)在教學(xué)結(jié)束后及時向動物倫理委員會進行補充說明。倫理委員會及時審查并評估合理性。教學(xué)使用動物的倫理規(guī)范實施后追蹤是教學(xué)改進的重要方式。

4.3 對涉及人的標本和細胞實驗研究

研究過程中更改實驗方案，更改細胞或組織類型，增加樣本來源等需要主動向倫理委員會提交倫理審查申請。此外，從人體補充獲取的細胞或組織需獲得受試者的知情同意。

4.4 對醫(yī)療器械動物實驗研究

醫(yī)療器械動物實驗的開展是經(jīng)決策評估后實施的，而實施后的倫理追蹤對保障動物福利是非常重要的環(huán)節(jié)。倫理委員會在核查過程中發(fā)生以下情況有權(quán)要求停止已開展的實驗[40]：實際操作人員未經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)，違反倫理原則要求的；實際實驗環(huán)境、飼養(yǎng)設(shè)施不合格的；實驗過程操作缺乏人性化、虐待動物的；活體解剖未麻醉、處死動物手段殘忍的；實驗動物極端痛苦而對人和動物無任何益處的；供試品和對照品在同一只(頭)動物受試的。

5 展望

替代動物實驗倫理涉及范圍廣泛、層次復(fù)雜，迄今為止已經(jīng)發(fā)展并論證了許多有效的替代動物方法，在減少實驗動物的使用上發(fā)揮了重要作用，然而目前尚無明確完備的關(guān)于替代動物實驗倫理的具體規(guī)范。根據(jù)3R原則分類，經(jīng)減少和優(yōu)化的動物實驗，現(xiàn)行的實驗動物倫理相關(guān)法規(guī)對其普遍適用；由低等動物或無脊椎動物替代高等動物可酌情使用現(xiàn)行相關(guān)倫理法規(guī)；而非生物實驗的倫理規(guī)范問題則需要在未來進行更多的探索。非生物方法的倫理規(guī)范的制定將有效推進替代動物實驗的發(fā)展和減少實驗動物的使用，這也是未來國內(nèi)替代動物研究倫理評估標準制定的重點發(fā)展方向。