WSSV和DIV1感染凡納濱對蝦對血淋巴凝固的影響

嚴栩蘅，廖栩崢，何建國，尹 斌，李朝政

(1.中山大學 海洋科學學院，珠海 519082; 2.中山大學 生命科學學院，廣州 510275；3.南方海洋科學與工程廣東省實驗室(珠海)，珠海 519082；4.嶺南現代農業(yè)科學與技術廣東省實驗室茂名分中心，茂名 525099)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)，是我國及全球重要的水產養(yǎng)殖物種之一[1]。病害是制約我國對蝦業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的主要瓶頸，其中以病毒性疾病危害最嚴重。白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus，WSSV)和十足類虹彩病毒1(decapod iridescent virus 1，DIV1)是引起對蝦病毒性病害的病毒。WSSV主要感染起源于外胚層和中胚層的組織細胞，造成不同組織廣泛的變性壞死[2]，其中以鰓、胃、頭胸甲和附肢的表皮細胞最敏感。病蝦患病初期常靜臥水底，甲殼上有白斑，出現空腸；患病后期體色泛紅，對外界反應遲鈍，死亡率極高，發(fā)病后3～14 d內死亡率可達100%[3-8]。DIV1是近年來在我國新發(fā)現的一種DNA病毒，主要感染鰓、肝胰臟、周足以及肌肉的造血組織和血細胞，有報道稱其還會感染來自外胚層的表皮和淋巴器官[9]。病蝦通常表現出空腸，肝胰腺萎縮，體色變淺，軟殼等癥狀，患病后期喪失游泳能力[9-11]。此外，DIV1感染的凡納濱對蝦有時會出現游泳足附近的甲殼發(fā)黑的癥狀[12]。

凝血系統(tǒng)是生物先天免疫的重要組成部分，通過形成穩(wěn)定的凝塊封閉傷口防止體液流失[13-14]，也可以與其它免疫反應協(xié)同參與宿主免疫[15-16]。凡納濱對蝦受到外來病原侵染時，鈣依賴性谷氨酰胺轉移酶(transglutaminase，TG)從血細胞中釋放，與血淋巴中的凝固蛋白(clotting protein，CP)形成交聯聚集體，避免外界微生物從傷口侵入[17-18]。目前在凡納濱對蝦中已鑒定出兩種TG，分別為I型(LvTGI)和II型(LvTGII)[19-21]。

甲殼類TG除參與凝血功能外，還在參與宿主免疫中發(fā)揮著重要作用。已有研究顯示，TG在中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)和凡納濱對蝦中參與了抗副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)[22]和溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)[23]等細菌的免疫反應。本研究以凡納濱對蝦為研究對象，通過qPCR和RNA干擾等方法，探究對蝦LvTGI、LvTGII等凝血系統(tǒng)相關基因在抗病毒免疫反應中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

凡納濱對蝦養(yǎng)殖于嶺南現代農業(yè)科學與技術廣東省實驗室茂名基地，對蝦規(guī)格為每尾5 g左右，實驗前在鹽度為2.5%的人工海水中暫養(yǎng)7 d以減少環(huán)境應激，每天投喂商品化的對蝦飼料3次，每天換水1次。

1.2 方法

1.2.1 WSSV和DIV1人工感染

取WSSV 或DIV1感染后的病蝦肌肉組織1 g置于勻漿器中，加入10 mL無菌PBS，勻漿后使用0.22 μm濾膜進行過濾，濾液即為病毒原液。根據絕對定量測定病毒濃度，使用無菌PBS稀釋濃度后用于人工感染實驗。經測定WSSV的感染濃度為3.62×103copies/μL，DIV1感染濃度為2.88×102copies/μL，實驗中每尾蝦注射50 μL病毒稀釋液。

將實驗用蝦分為2個實驗組和1個對照組，每組各90尾對蝦，在養(yǎng)殖桶中暫養(yǎng)72 h后，轉移至玻璃箱中進行WSSV和DIV1人工感染實驗。采用肌肉注射感染方法，使用1 mL胰島素注射器將稀釋后的WSSV和DIV1 病毒液注入凡納濱對蝦第二腹肢肌肉內，對照組注入無菌PBS，每尾蝦注射50 μL。注射感染病毒后每隔12 h采集對蝦鰓和肝胰腺組織存放于RNAlater中，于-80°C保存，用于后續(xù)實驗檢測。

1.2.2 凝血現象觀察

凡納濱對蝦感染病毒后，使用2 mL注射器每隔12 h采集1 mL對蝦血淋巴(不添加ACD抗凝劑)，置于2 mL離心管中，于4 °C保存，用于拍照觀察。

1.2.3 總RNA提取及cDNA合成

將保存于RNA later中的凡納濱對蝦各組織提取總RNA，所用相關器皿及試劑提前做相應處理去除RNase污染。稱取0.5 g對蝦鰓組織或肝胰腺組織放入液氮預冷的研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，轉入2 mL離心管中，使用RNeasy Mine 試劑盒(Qiagen，Germany)提取總RNA，提取方法如說明書所示。提取RNA經過Bioanalyzer 2100進行濃度與純度測定，之后使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。使用SYBR PrimeScript RT-PCR Kit(Perfect Real Time)試劑盒合成cDNA。

1.2.4 定量PCR(qPCR)

根據LvCP、LvTGI和LvTGII的mRNA序列設計針對上述基因的特異性qPCR引物，以EF-1α作為內參基因。qPCR反應體系：5 μL SYBR Mix，0.2 μL正向/反向特異性引物，3.6 μL RNase-free H2O，總體系為10 μL。反應條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，40個循環(huán)；95 ℃反應5 s，60 ℃反應1 min以獲得熔解曲線；最后設定50 ℃降溫30 s。每份樣品進行3次重復，用Livak法(2-ΔΔCt)對結果進行分析計算mRNA相對表達量。引物序列見表1。

1.2.5 dsRNA合成

重新設計PCR引物擴增LvTGI和LvTGII后回收片段連接至pMD-19T載體上，將連接產物轉化到大腸桿菌DH5α菌株中，挑取單菌落進行菌落PCR驗證，重組質粒送至公司進行測序，確認序列來自LvTGI和LvTGII后作為dsRNA第一鏈合成模板。設計含有T7序列的特異性引物，按照T7 RiboMAX Express RNAi System(promega)試劑盒說明書合成dsRNA。dsRNA引物序列同表1。

表1 本文所用引物信息

1.2.6 RNA干擾(RNAi)及死亡率統(tǒng)計

將實驗用蝦分為2個實驗組和1個對照組，每組各100尾。前期在養(yǎng)殖桶中暫養(yǎng)72 h后，轉移至玻璃箱中進行實驗。每尾蝦注射10 μg dsRNA用于干擾目的基因的表達。dsRNA注射后48 h，采集鰓組織用于提取總RNA。采用qPCR方法對LvTGI和LvTGII的表達量進行分析，驗證RNAi的干擾效率。注射dsRNA 48 h后，采用同1.2.1的方法進行WSSV和DIV1人工感染。每隔4 h進行一次觀察計數，統(tǒng)計7 d內的累積死亡率。檢測樣品制備方法見1.2.3，檢測干擾效率的qPCR引物同表1。

1.2.7 數據統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 WSSV和DIV1感染影響血淋巴凝固

感染病毒后，每隔12 h抽取對蝦血淋巴，觀察血淋巴的凝固情況。正常情況下，對蝦血淋巴從體內抽出后，幾分鐘內就會從液體狀轉變成不可流動的膠體狀。在WSSV及DIV1感染后12、24 h血淋巴均能凝固[圖1(a)和(b)]，在WSSV及DIV1感染60 h后，對蝦血淋巴不再凝固，保持可流動的液體狀態(tài)[圖1(e)和(f)]。DIV1對血淋巴凝固的影響強于WSSV，在感染36 h后血淋巴不再呈膠體狀[圖1(c)(d)(e)和(f)]，而WSSV在感染60 h后才出現不凝固的現象[圖1(e)和(f)]。結果表明，兩種病毒感染均會影響凡納濱對蝦血淋巴凝固。

(a)～(f)分別為感染WSSV和DIV1在12 h(a)、24 h(b)、36 h(c)、48 h(d)、60 h(e)和72 h(f)時觀察血淋巴凝固的情況，最左側為注射PBS的對照組。

2.2 凝血相關基因響應WSSV和DIV1表達

人工感染WSSV和DIV1后，采用qPCR方法檢測凡納濱對蝦凝血系統(tǒng)相關基因LvCP、LvTGI和LvTGII分別在鰓組織和肝胰腺中的表達量。結果顯示：在鰓組織中，LvCP與LvTGI的表達整體受到抑制。LvCP在WSSV感染12 h到60 h內的表達量顯著下調[圖2(a)]。LvTGI在兩種病毒感染24 h后的表達量都顯著下降[圖2(b)]。LvTGII在WSSV感染后的表達量顯著上調，在72 h時表達量最高，是對照組的17倍，而在DIV1感染24 h到48 h內顯著下調[圖2(c)]。在肝胰腺中，LvCP在WSSV感染后表達量顯著上調，在DIV1感染后的表達趨勢先上升后下降[圖2(d)]。LvTGI在兩種病毒感染24 h后的表達量均顯著下調[圖2(e)]。值得注意的是，LvTGII在肝胰腺中的表達情況與在鰓組織中相反，在WSSV感染12 h到48 h內的表達趨勢下降，而在DIV1感染后表達量顯著上調[圖2(f)]。結果證實病毒感染會影響凡納濱對蝦凝血系統(tǒng)相關基因的表達，推測凡納濱對蝦TG是病毒與凝血系統(tǒng)相互作用的靶點。

(a)～(c)分別為LvCP、LvTGI、LvTGII在鰓組織中的表達情況；(d)～(f)分別為LvCP、LvTGI、LvTGII在肝胰腺中的表達情況。* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001。

2.3 敲降凝血相關基因抑制血淋巴凝固且增加對蝦對WSSV或DIV1的易感性

為了進一步探究凡納濱對蝦凝血相關基因TG是否參與抗病毒免疫反應，采用RNAi方法敲降LvTGI和LvTGII，48 h后人工注射WSSV或DIV1，統(tǒng)計累積死亡率情況。qPCR結果顯示，RNA干擾后LvTGI和LvTGII的表達量都顯著低于對照組，表明dsRNA能夠有效地敲降LvTGI和LvTGII基因[圖3(a)]。敲降LvTGI和LvTGII后的蝦血呈明顯的流動液體狀[圖3(b)]，進一步證實了LvTGI和LvTGII為凝血系統(tǒng)中的關鍵基因。對病毒感染后的累積死亡率進行統(tǒng)計分析，敲降LvTGI和LvTGII后的患病對蝦累積死亡率顯著高于其對照組，且敲降LvTGII比敲降LvTGI對病毒感染后死亡情況的影響程度更大[圖3(c)(d)和(e)]。結果表明，敲降凝血相關基因(LvTGI和LvTGII)干擾了血淋巴凝固及增加了對蝦對WSSV和DIV1的易感性。

(a)～(e)分別為注射dsRNA后，鰓組織中RNAi干擾效率檢測(a)、敲降LvTGI和LvTGII 48 h后的凝血現象觀察(b)、單獨敲降LvTGI和LvTGII后對蝦死亡情況(c)、敲降LvTGI和LvTGII后感染WSSV對蝦累積死亡率(d)、敲降LvTGI和LvTGII后感染DIV1對蝦累積死亡率(e)；* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001。

3 討論與結論

大部分無脊椎動物擁有開放式循環(huán)系統(tǒng)，血淋巴通過開放式循環(huán)系統(tǒng)在各個組織間流動，其在運輸氧氣、傳遞信號、修復損傷、抵御病原入侵等方面發(fā)揮至關重要的作用。血淋巴凝結通常指無脊椎動物中由多種蛋白參與的一類復雜生物學過程，其生物學效應為使得流動的血淋巴變成不能流動的膠凍狀凝塊。因為是開放式循環(huán)系統(tǒng)，無脊椎動物相比脊椎動物更加依賴血淋巴來維持體液穩(wěn)態(tài)和抵御由體表創(chuàng)傷引起的病原入侵。本研究主要探討了兩種水產DNA病毒(WSSV和DIV1)感染對宿主(對蝦)血淋巴凝結的影響，以及對蝦凝血相關基因在抵御病毒感染過程中的作用。

3.1 WSSV和DIV1感染對蝦抑制血淋巴凝結

對蝦血淋巴可能是多種不同病原感染后的共同作用位點。我們發(fā)現凡納濱對蝦感染WSSV或DIV1后都會出現血淋巴凝固被抑制或不凝固的現象。已有研究報道，凡納濱對蝦感染桃拉綜合征病毒(taura syndrome virus, TSV)后也會出現血淋巴凝固不良的現象[24]，哈維弧菌(Vibrioharveyi)感染或其細胞外產物同時會導致血淋巴不凝結的現象[25]。這些報道表明，血淋巴是凡納濱對蝦免疫反應的部位之一，在不同病原感染過程中可能發(fā)揮重要的作用，病原感染會不同程度地破壞或抑制血淋巴正常凝集功能。

3.2 凝血相關基因LvTGI、LvTGII及CP不同程度地響應兩種病毒感染

病毒感染會導致血淋巴凝固異常，表明凝血相關基因的表達可能會受到病毒感染的影響，凝血系統(tǒng)與抗病毒免疫之間存在關聯性。在WSSV和DIV1感染下，LvCP在鰓組織中的表達量被明顯抑制，而在肝胰腺中的表達量呈現先上升后下降的現象。Yeh等[26]發(fā)現在斑節(jié)對蝦CP在鰓組織中表達量較高，而在肝胰腺中表達量較低。綜上結果推測，在病毒感染后不同組織的CP響應感染的程度不同。然而，當前我們仍不知道這種上調是否是主動應對感染以維持血淋巴的正常功能，以及下調是否是由病毒感染出現的被動行為(抑制表達)。LvTGI在兩種病毒感染后，在鰓組織和肝胰腺組織均被顯著抑制，因此，LvTGI可能是探究宿主基因響應這兩種病毒感染是否是被動行為的重要候選基因。LvTGII在受到病毒刺激后，在不同部位均有表達量上調的情況出現，然而，LvTGII在面對不同病毒感染時的表達模式存在差異：WSSV刺激后，LvTGII在鰓組織中表達量顯著上調，而在肝胰腺中的表達量則先下降，后上升；DIV1刺激后，LvTGII在鰓組織的表達中受到抑制，而在肝胰腺中則顯著上調表達。已有研究顯示，WSSV主要感染鰓組織與上皮細胞[27]，DIV1主要感染對蝦血細胞與肝胰腺等[28]，推測病毒感染后LvTGII表達量變化可能與病毒侵染部位有關，具體機制有待深入研究。

3.3 LvTGI和LvTGII在血淋巴凝結以及宿主防御病毒侵染中發(fā)揮重要作用

LvTGI和LvTGII是凡納濱對蝦TG的兩種亞型，為了驗證TG的免疫作用，使用RNAi敲降LvTGI和LvTGII，并統(tǒng)計敲降后對蝦感染病毒后的死亡率情況。抑制LvTGI和LvTGII表達均會出現血淋巴明顯不凝固的現象，表明凡納濱對蝦LvTGI和LvTGII都是凝血系統(tǒng)的關鍵基因。在感染兩種病毒后，敲降LvTGI和LvTGII的對蝦都出現了累積死亡率上升的情況，且敲降LvTGII對死亡率的影響比敲降LvTGI更明顯。已有報道表明TG在抗病免疫中起到了積極作用：Maningas等[29]發(fā)現在日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)中敲降TG會加速感染WSSV對蝦的死亡。而Fagutao等[30]發(fā)現TG的沉默會導致兩種抗菌肽(甲殼素和溶菌酶)的表達量顯著下調，表明TG參與某些抗菌肽的表達調控。結果明確了凡納濱對蝦LvTGI和LvTGII均參與了抗病毒免疫反應。然而，在兩種病毒感染下，LvTGI在不同組織中的表達量均受到抑制，關于LvTGI參與免疫反應的機制還需進一步研究。

病毒往往需要克服甚至破壞宿主抗病毒免疫來獲得成功感染。WSSV和DIV1均能破壞對蝦血淋巴凝集反應，且敲降凝血關鍵基因顯著增加了對蝦對病毒的易感性。因此，我們推測對蝦血淋巴的凝固作用可能與宿主抗病毒免疫反應密切相關。本研究為進一步解析凝血系統(tǒng)參與宿主抗病毒免疫反應的機理奠定了基礎。