基于微流控芯片裝置的臨床患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞分選及分析

姜佳寧 王 琪 王若雨 高金琦 陳雯婷 王 剛

大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院腫瘤科，遼寧大連 116001

惡性腫瘤的發(fā)病率、死亡率逐年呈穩(wěn)定上漲趨勢(shì)，發(fā)病年齡則出現(xiàn)年輕化趨勢(shì)[1]。隨著腫瘤發(fā)病機(jī)制探討、新藥研發(fā)、診療手段的不斷規(guī)范化、精準(zhǔn)化，患者的診斷率、治療有效率都有了明顯的提升。然而，惡性腫瘤細(xì)胞通常具備高侵襲能力，一旦出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移，將大大提高患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)[2]。雖現(xiàn)有技術(shù)已明顯提高了腫瘤患者的檢出率，但對(duì)于精準(zhǔn)診療、評(píng)估預(yù)后、評(píng)價(jià)療效等方面存在很多不足之處，仍有很大一部分患者就診時(shí)已處于晚期，失去最佳治療機(jī)會(huì)。提高惡性腫瘤患者的早期檢出率是解決問題的關(guān)鍵。隨著循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTC）的出現(xiàn)及不斷深入研究，CTC 分選作為一種“液態(tài)病理活檢”技術(shù)，可協(xié)助臨床診斷明確、轉(zhuǎn)移評(píng)估、預(yù)后判斷、療效評(píng)價(jià)及精準(zhǔn)個(gè)體化醫(yī)療的指導(dǎo)[3-4]。美國強(qiáng)生公司開發(fā)的CellSearch System 是唯一被食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)，用于臨床乳腺癌、肺腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌患者的CTC檢測(cè)。但該裝置因檢測(cè)成本高、操作復(fù)雜、體積笨重等不足，尚未廣泛應(yīng)用于臨床患者CTC檢測(cè)。因此，如何實(shí)現(xiàn)臨床CTC 快速、方便、準(zhǔn)確的檢測(cè)一直是研究的熱點(diǎn)。微流控芯片技術(shù)具備微型化、自動(dòng)化、集成化和便攜化等優(yōu)勢(shì)，彌補(bǔ)傳統(tǒng)檢測(cè)方法的不足，在生物技術(shù)、醫(yī)學(xué)、物理研究等方面均有所應(yīng)用[5]。因此，利用微流控芯片的優(yōu)勢(shì)，構(gòu)建集成化的CTC 分選裝置，克服了CellSearch System的不足，具備成本低、無創(chuàng)、簡(jiǎn)單、可重復(fù)、順應(yīng)性好等優(yōu)勢(shì)，并可獲得高達(dá)90%以上的檢測(cè)率，更適合于臨床患者CTC的檢測(cè)[6]。本研究將應(yīng)用該檢測(cè)裝置對(duì)55 例臨床腫瘤患者外周血標(biāo)本CTC 分選，分析CTC 分選結(jié)果與患者臨床病理特征，包括發(fā)病年齡、性別、腫瘤分化程度、分期、類別、腫瘤轉(zhuǎn)移及療效評(píng)價(jià)的相關(guān)性。以期進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)該裝置的臨床普及應(yīng)用，為提高腫瘤患者的診斷及治療提供更好的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 倒置熒光顯微鏡、光刻機(jī)、甩膠機(jī)、等離子去膠機(jī)、超凈工作臺(tái)、二氧化碳水套式培養(yǎng)箱、LS100CO2 激光雕刻機(jī)、OB1 pressure controller、熱壓機(jī)、低溫高速離心機(jī)。

1.1.2 試劑 芯片制備試劑：PDMS、固化劑、CD45 磁珠、紅細(xì)胞裂解液。免疫親和反應(yīng)試劑：鼠尾膠原蛋白、EpCAM 抗體、CD45 抗體、panCytokerin 抗體。

1.1.3 研究對(duì)象 本研究納入2017 年1 月至2018 年12 月在大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院確診的惡性腫瘤患者共55 例，每例患者抽取外周靜脈血4 ml。其中男25 例，女30 例；年齡42～82歲，平均（61.02 ±19.14）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：初治經(jīng)病理證實(shí)的惡性腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在肝腎功能異常及心、腦、精神系統(tǒng)等疾病等。②臨床資料不完整。本項(xiàng)研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意批準(zhǔn)（批號(hào)：2017071）。參與的患者或家屬均知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 基于微流控芯片的CTC 分選裝置構(gòu)建 本研究利用微流控芯片技術(shù)平臺(tái)，構(gòu)建了集成化的CTC 分選平臺(tái)。該平臺(tái)由DLD 芯片、磁場(chǎng)負(fù)性純化芯片及鼠尾膠原蛋白捕獲組成。DLD 芯片的設(shè)計(jì)是依據(jù)CTC的物理學(xué)特性，其尺寸為15～20 μm,明顯大于紅細(xì)胞、血小板及95%以上白細(xì)胞。磁場(chǎng)負(fù)性純化平臺(tái)是依據(jù)白細(xì)胞表面特異性表達(dá)CD45 抗體，因此經(jīng)DLD分選后的樣本經(jīng)過CD45 磁珠充分作用后，在磁場(chǎng)負(fù)性分離作用下將白細(xì)胞進(jìn)一步去除。最后，CTC 與極少量的白細(xì)胞通過正性分選免疫親和反應(yīng)被捕獲，CTC 表達(dá)為EPCAM+/CK+/CD45-，白細(xì)胞表達(dá)為EPCAM-/CK-/CD45+，整體示意圖見圖1[6]。

1.2.2 標(biāo)本采集 應(yīng)用EDTA 抗凝管留取患者初治前、治療后的外周靜脈血標(biāo)本各4 ml，室溫保存，6 h 內(nèi)完成檢測(cè)。

1.2.3 臨床腫瘤患者外周血CTC 分選 應(yīng)用既往設(shè)計(jì)的微流控芯片裝置分選CTC，記錄每例患者外周血的CTC 情況，分析檢測(cè)結(jié)果與患者發(fā)病年齡、性別、腫瘤診斷、臨床分期、分化程度等臨床資料的相關(guān)性。

1.3 觀察指標(biāo)

分析患者CTC 分選結(jié)果與患者性別、年齡、診斷、分期、癌腫不同及腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。同時(shí)，對(duì)于接受抗腫瘤治療的患者，觀察治療前后CTC 數(shù)目的變化與臨床影像學(xué)（CT、彩超、核磁等）評(píng)效的一致性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；療效評(píng)價(jià)分析采用Kappa 一致性檢驗(yàn)。其中Kappa≥0.75 為兩者一致性較好；0.75＞Kappa≥0.4 為兩者一致性一般；Kappa＜0.4 為兩者一致性較差。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 55 例患者一般臨床病理特征

55 例惡性腫瘤患者中CTC 陽性例數(shù)為29 例，檢出率為52.73%，共檢出178個(gè)CTC。檢出率與腫瘤分化及腫瘤TNM 分期有關(guān)（P ＜0.05），與發(fā)病年齡、性別及不同腫瘤類別無關(guān)（P ＞0.05）。見表1。

表1 55 例患者一般臨床病理特征及基線CTC 計(jì)數(shù)分析

2.2 CTC檢測(cè)結(jié)果與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系

上述55 例患者中，29 例檢測(cè)結(jié)果為陽性，其中28 例臨床已證實(shí)有明確的轉(zhuǎn)移灶，即CTC檢出率為陽性的患者中，96.6%的患者存在轉(zhuǎn)移。對(duì)于檢測(cè)結(jié)果為陰性的26 例患者中，18 例存在轉(zhuǎn)移。檢出率與腫瘤轉(zhuǎn)移情況相關(guān)（χ2=5.613，P ＜0.05）。

2.3 CTC檢測(cè)數(shù)目變化與影像學(xué)檢查結(jié)果評(píng)估療效的關(guān)系

在55 例患者中，剔除去首診后拒絕行抗腫瘤治療的患者及早期未檢測(cè)到CTC 后續(xù)復(fù)查仍檢測(cè)結(jié)果為陰性的患者，共39 例患者納入進(jìn)一步分析。于治療（化療、放療、分子靶向治療、內(nèi)分泌治療）前后分別檢測(cè)外周血中CTC 數(shù)目，同時(shí)行胸腹部CT 等相關(guān)檢查，根據(jù)RECIEST 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)效。在39 例患者中，26 例患者治療后復(fù)查CTC 數(shù)目上升，經(jīng)臨床檢查：血清腫瘤標(biāo)志物及影像學(xué)，包括CT、MRI、全身骨顯象、超聲等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中8 例患者病情復(fù)發(fā)，16 例患者病情進(jìn)展，療效評(píng)價(jià)為進(jìn)展，2 例患者病情穩(wěn)定，療效評(píng)價(jià)穩(wěn)定。對(duì)于CTC檢測(cè)結(jié)果不變或下降的13 例患者，其中9 例患者為治療后復(fù)查未見腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移征象。4 例患者為行下周期化療入院，臨床療效評(píng)價(jià)部分緩解或穩(wěn)定。通過Kappa 一致性檢驗(yàn)分析，結(jié)果提示CTC檢測(cè)情況與RECIEST 標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)效果存在良好的一致性（Kappa=0.889，P ＜0.001）。見表2。

表2 CTC 變化與影像療效評(píng)價(jià)關(guān)系統(tǒng)計(jì)表

3 討論

惡性腫瘤通常分化程度差、惡性程度高，早期易發(fā)生轉(zhuǎn)移，一旦出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后極差，生存期嚴(yán)重縮短，死亡率大幅度提高[7]。現(xiàn)有的腫瘤檢查技術(shù)手段對(duì)明確診斷、判斷預(yù)后及指導(dǎo)治療存在一定的局限，主要有影像學(xué)、血清腫瘤標(biāo)志物、組織病理學(xué)和細(xì)胞學(xué)檢查等。影像學(xué)檢查雖能直觀地評(píng)價(jià)腫瘤的大小和侵及范圍，但靈敏度低，對(duì)微小病灶檢出率低。血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)可用于輔助診斷、監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展和復(fù)發(fā)，但是目前尚缺少特異的腫瘤標(biāo)志物，假陽性率和假陰性率較高。病理學(xué)診斷是腫瘤診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但通過手術(shù)或穿刺方法獲得活檢樣本的方法對(duì)患者的創(chuàng)傷較大。另外，取材受限常導(dǎo)致無法實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的監(jiān)測(cè)。CTC 與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，CTC 分選有助于預(yù)測(cè)及明確腫瘤轉(zhuǎn)移，并反映腫瘤特征，為腫瘤診治提供依據(jù)，也可作為靶向治療的靶標(biāo)指導(dǎo)治療方案的制訂[8]。且采集外周血具備創(chuàng)傷小、順應(yīng)性好、操作方便及可重復(fù)等優(yōu)勢(shì)，有望克服臨床腫瘤診療的難題。

現(xiàn)有的CTC 分選原理主要依據(jù)兩方面，基于物理學(xué)特性[9-11]及生物學(xué)特性進(jìn)行分選[12-16]。本研究構(gòu)建的基于微流控芯片的集成化的CTC 分選裝置，融合了二者優(yōu)勢(shì)，克服了各自的不足。首先，基于CTC的尺寸遠(yuǎn)大于正常外周血細(xì)胞（紅細(xì)胞、血小板及大部分白細(xì)胞）的物理學(xué)特性，構(gòu)建了CTC 初步快速的分選芯片—DLD 芯片，在1 ml/min的通量下實(shí)現(xiàn)CTC 初步快速的分選，通過該芯片可使95%以上的白細(xì)胞、全部紅細(xì)胞、血小板被去除。隨后，依據(jù)白細(xì)胞表面特異性表達(dá)CD45，構(gòu)建自動(dòng)化的磁性負(fù)性純化裝置，進(jìn)一步去除殘余白細(xì)胞90%以上。最后，利用CTC的生物學(xué)特性進(jìn)行免疫親和鑒定反應(yīng)，最終CTC 表達(dá)EPCAM+/CK+/CD45-，與白細(xì)胞表達(dá)EPCAM-/CK-/CD45+被分離鑒定。本研究前期研究還通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株的檢測(cè)實(shí)現(xiàn)90%以上檢測(cè)率，并將對(duì)臨床患者CTC 分選結(jié)果與CellSearch System 對(duì)比，發(fā)現(xiàn)該裝置的分選效率優(yōu)于CellSearch System，且在檢測(cè)成本、方便性、所需樣本量、檢測(cè)時(shí)間等方面均具備明顯優(yōu)勢(shì)[6]。

為實(shí)現(xiàn)該裝置的臨床應(yīng)用，本研究中應(yīng)用該裝置檢測(cè)了55 例臨床初治的惡性腫瘤患者CTC，CTC 陽性為29 例，檢出率為52.73%，通過χ2檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)CTC檢出率與腫瘤分化程度、腫瘤分期及臨床轉(zhuǎn)移相關(guān)（P ＜0.05），而與性別、年齡及癌種無關(guān)（P ＞0.05）。這與目前大多數(shù)臨床CTC檢測(cè)結(jié)果分析一致[17-21]。此外，本研究對(duì)接受治療的39 例患者進(jìn)行了治療后的CTC 復(fù)查，為臨床療效評(píng)價(jià)，予以完善胸腹部CT、乳腺、淺表淋巴結(jié)彩超等檢查，探討治療前后相同患者CTC檢測(cè)水平變化與影像學(xué)評(píng)效的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)于CTC 數(shù)目升高26 例患者中，24 例出現(xiàn)了病情進(jìn)展，另2 例影像學(xué)評(píng)效縮小或穩(wěn)定，腫瘤標(biāo)志物出現(xiàn)輕度升高，不除外處于腫瘤進(jìn)展的早期，臨床嚴(yán)密觀察。而對(duì)于CTC 數(shù)目下降或不變的13 例患者，療效評(píng)價(jià)均為SD 或PR，Kappa檢驗(yàn)提示二者的結(jié)果一致（P ＞0.05）。因此，本研究提出利用CTC的動(dòng)態(tài)檢測(cè)可協(xié)助臨床療效的評(píng)價(jià)，指導(dǎo)治療，與現(xiàn)有臨床報(bào)導(dǎo)相符[22-26]。

因此，本研究提出CTC檢測(cè)有助于協(xié)助臨床評(píng)估腫瘤分化程度、預(yù)測(cè)分期、明確轉(zhuǎn)移，并起到療效評(píng)價(jià)、指導(dǎo)治療的作用。而本研究設(shè)計(jì)的基于微流控芯片的CTC檢測(cè)裝置具備檢測(cè)率高、檢測(cè)成本低、檢測(cè)方便等優(yōu)勢(shì)，有望實(shí)現(xiàn)CTC的臨床普及應(yīng)用，協(xié)助提高臨床患者診治率，提高患者生存質(zhì)量、延長(zhǎng)生存期。