鼻咽癌組織中TRIM59、PPM1B的表達及臨床意義

劉 旭 周 強 蒲高祥 劉曉梅

四川省遂寧市中心醫(yī)院腫瘤科，四川遂寧 629000

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是發(fā)病于鼻咽部黏膜的上皮性惡性腫瘤。2018 年全球新發(fā)患病數(shù)達12.8 萬例，死亡例數(shù)達5 萬例[1]。目前，NPC的臨床治療以放化療為主，但晚期患者生存預(yù)后較差，5 年生存率僅為50%[2]。三結(jié)構(gòu)域蛋白59（tripartite motif-containing 59，TRIM59）是一種參與泛素-蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移過程的蛋白質(zhì)，可作為先天免疫信號通路中的多功能調(diào)節(jié)劑[3]。TRIM59 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肺癌中發(fā)揮促癌功能，如TRIM59 通過上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白來促進表皮生長因子受體突變的肺腺癌細(xì)胞的增殖和遷移[3-4]。蛋白磷酸酶1B（protein phosphatase 1B，PPM1B）是絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶（PP2C）的家族成員，能夠負(fù)向調(diào)控細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)[5]。據(jù)報道，在膀胱癌、乳腺癌等惡性腫瘤中PPM1B 低表達會促進腫瘤細(xì)胞的增殖，促進腫瘤惡性進展[6-7]。因此，本研究通過分析NPC 中TRIM59、PPM1B的表達，探討兩者的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014 年2 月至2018 年2 月四川省遂寧市中心醫(yī)院（以下簡稱“我院”）診治的97 例NPC 患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①局部組織病理活檢明確診斷為鼻咽部鱗癌；②初診，既往未接受過放化療等；③患者及家屬對本研究知情同意；④臨床和隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并鼻咽部急性炎癥；②鼻咽部其他類型腫瘤或合并其他臟器腫瘤；③伴心肺等臟器功能不全。其中男60 例，女37 例；年齡35～76歲，平均年齡（59.4±6.1）歲；吸煙史：有33 例，無64 例；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期65 例，Ⅲ～Ⅳ期32 例；腫瘤分化：高中分化35 例，低分化62 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有55 例，無42 例。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核批準(zhǔn)通過。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色法檢測TRIM59、PPMIB 表達 在手術(shù)局部組織活檢過程中，取癌組織和癌旁組織（距腫瘤邊緣2 cm，病理明確為正常黏膜組織）約50 mg，10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片。實驗步驟按照免疫組織化學(xué)染色法檢測，試劑盒購于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司（貨號E-IR-R213）。一抗TRIM59 稀釋比1∶1000，PPM1B 稀釋比1:400，均購于Abcam 公司（貨號ab69639、ab244353）。200 倍鏡下觀察結(jié)果（倒置顯微鏡，日本奧林巴斯株式會社，型號：CKX53），染色評分根據(jù)染色強度和陽性染色面積的乘積計算[8]。染色強度：不著色為0 分，淺黃色為1 分，棕黃色顆粒為2 分，顏色深為3 分。染色面積：無著色為0 分，<25%為1 分，25%～50%為2 分，>50%為3分。染色評分≥3 分判定為染色陽性。

1.2.2 隨訪方法 所有患者出院后開始進行隨訪，每3個月電話隨訪1 次，隨訪內(nèi)容為患者生存狀態(tài)，連續(xù)隨訪3 年，隨訪截至2021 年2 月或患者死亡。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；相關(guān)性采用Spearman 秩相關(guān)分析；Kaplan-Meier 生存曲線分析TRIM59、PPM1B 表達對NPC 患者預(yù)后的影響，并采用log-rank檢驗進行差異分析。以P <0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NPC 患者中TRIM59、PPM1B的陽性表達情況

TRIM59 陽性染色主要位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核，PPM1B 陽性染色主要位于細(xì)胞核，部分位于細(xì)胞漿。NPC 癌組織中TRIM59、PPM1B 陽性表達率分別為69.07%（67/97）、26.80%（26/97）；癌旁組織中TRIM59、PPM1B 陽性表達率分別為28.87%（28/97）、68.04%（66/97）。與癌旁組織比較，癌組織中TRIM59 陽性表達率明顯較高（χ2=31.374，P ＜0.001），而PPM1B 陽性表達率明顯較低（χ2=33.078，P ＜0.001）。見圖1。

2.2 NPC 患者中TRIM59、PPM1B 相關(guān)性分析

TRIM59 與PPM1B 表達呈負(fù)相關(guān)（r=-0.524，P ＜0.001）。

2.3 TRIM59、PPM1B 表達與NPC 患者臨床特征的關(guān)系

Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NPC 患者TRIM59 陽性表達率、PPM1B 陰性表達率高于Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NPC 患者（P <0.05）。見表1。

表1 RIM59、PPM1B 表達與NPC 患者臨床特征的關(guān)系[例（%）]

2.4 TRIM59、PPM1B 表達對NPC 患者預(yù)后的影響

對97 例NPC 患者隨訪2～36個月，中位隨訪32個月（13～36個月）。隨訪期間失訪3 例，死亡27 例，3 年生存率為71.27%（67/94）。Kaplan-Meier 生存分析結(jié)果顯示，TRIM59 陽性表達組3 年生存率[63.08%（41/65）] 低于陰性表達組[89.66%（26/29）]（log-rank χ2=4.822，P=0.006）；PPM1B 陽性表達組3年生存率[92.00%（23/25）]高于陰性表達組[63.77%（44/69）]（log-rank χ2=6.041，P ＜0.001）。見圖2。

3 討論

NPC 是鼻咽腔的惡性腫瘤。目前認(rèn)為，遺傳易感性、環(huán)境因素、EB 病毒感染等多種因素均參與NPC的發(fā)生發(fā)展[9-10]。NPC 惡性程度較高，腫瘤分化不良，病理上非角化型鱗癌最為常見[11]。NPC 由于位置隱匿，發(fā)現(xiàn)時常為中晚期[12]。放化療是NPC的首選治療方式，提高了腫瘤的局部控制率，并延長患者生存時間[13]。但治療后腫瘤發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移仍然是治療失敗的主要因素[14]。因此，深入研究NPC的疾病機制，尋找能夠有效預(yù)測NPC 患者預(yù)后的分子標(biāo)志物，有助于臨床治療方式和治療后隨訪方案的選擇，是近年來的研究熱點[15-16]。

TRIM 家族包括70 多個成員，該家族蛋白結(jié)構(gòu)上具有一個RBCC 結(jié)構(gòu)域和N 末端環(huán)手指結(jié)構(gòu)域，功能上具有E3 泛素連接酶的作用，參與包括細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)、發(fā)育、細(xì)胞凋亡等細(xì)胞過程[17]。TRIM59 在肺癌、乳腺癌、肝癌等許多癌癥中表達上調(diào)，并且TRIM59高表達患者的遠(yuǎn)期生存預(yù)后較差，是腫瘤患者不良預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物[18-19]。本研究結(jié)果顯示，NPC 患者腫瘤組織中TRIM59的陽性表達率明顯較高，提示NPC 中TRIM59 表達上調(diào)。TRIM59的表達受到多種因子的調(diào)控。既往研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤中表皮生長因子受體活化能激活細(xì)胞周期素激酶5（cyclin-dependent kinase 5，CDK5），CDK5 能夠順式促進TRIM59的表達，促進腫瘤細(xì)胞的增殖[3]。此外，本研究結(jié)果顯示，NPC 患者TRIM59 陽性表達與TNM 分期及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示TRIM59 表達上調(diào)參與促進NPC的發(fā)生發(fā)展。有研究報道，TRIM59 表達能夠穩(wěn)定程序性細(xì)胞死亡蛋白10，進而抑制自噬相關(guān)蛋白p62 賴氨酸63 位的泛素化，p62 降解減少后激活Ras 家族成員A，促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。此外，TRIM59 可以被外泌體包裹后釋放到腫瘤微環(huán)境，激活腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥小體，促進巨噬細(xì)胞向M2 型轉(zhuǎn)化，促進免疫抑制狀態(tài)的形成[20]。

PPM1B 是金屬依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族的成員。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PPM1B 作為腫瘤增殖信號傳導(dǎo)途徑的重要負(fù)調(diào)節(jié)因子，通過直接抑制P38和JNK 途徑蛋白激酶的磷酸化激活，發(fā)揮抑制腫瘤增殖的作用[21]。既往研究發(fā)現(xiàn)，NPC 中存在P38和JNK 途徑的過度激活[22]。鑒于PPM1B 對P38和JNK途徑的負(fù)調(diào)節(jié)作用，PPM1B 可能是NPC 中潛在的抑癌基因。本研究結(jié)果顯示，NPC 腫瘤組織中PPM1B 陽性表達率較低，提示NPC 中PPM1B 表達下調(diào)。分析其原因可能與非編碼RNA的表達調(diào)控有關(guān)。Yang 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤中PPM1B 受到上游miR-186的表達調(diào)控，miR-186 異常升高能夠顯著抑制PPM1B的表達，促進G1向S 期轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致腫瘤過度增殖。此外，本研究結(jié)果顯示，NPC 中PPM1B 表達與TNM 分期及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示PPM1B 表達下調(diào)參與促進NPC的腫瘤進展。PPM1B 在腫瘤中主要發(fā)揮腫瘤抑制的作用，Cho 等[23]動物實驗結(jié)果表明，PPM1B 低表達導(dǎo)致癌基因RhoGDl1的磷酸化激活，RhoGDl1 通過激活RhoA的表達，促進人乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，促進轉(zhuǎn)移。亦有學(xué)者在NPC 腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，RhoA信號通路有過度激活的現(xiàn)象[24]。因此，NPC 中PPM1B的低表達可能是通過激活下游RhoA 通路發(fā)揮腫瘤促進的作用。本研究結(jié)果顯示，TRIM59 與PPM1B 呈負(fù)相關(guān)，提示兩者可能存在相互作用的關(guān)系。王文忠等[25]報道，NPC 細(xì)胞（HNE1）中PPM1B 是TRIM59的下游靶基因，TRIM59 表達升高能夠通過靶向抑制PPM1B 表達，促進HNE1 細(xì)胞的遷移和侵襲。因此，TRIM59 可能通過抑制PPM1B 發(fā)揮促進NPC 腫瘤進展的功能。本研究結(jié)果顯示，TRIM59 陽性表達、PPM1B 陰性表達患者的生存預(yù)后較差。提示檢測NPC 癌組織中TRIM59 與PPM1B 表達有助于患者臨床預(yù)后預(yù)測，是新的判斷預(yù)后的標(biāo)志物。

綜上所述，NPC 中TRIM59 陽性表達率較高，而PPM1B 陽性表達率較低。NPC 中TRIM59、PPM1B的表達與TNM 分期和淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)。臨床上，可根據(jù)TRIM59、PPM1B 表達情況對患者病情、預(yù)后進行評估，指導(dǎo)臨床治療方案的選擇。但本研究未對TRIM59、PPM1B 之間作用機制進行探索，有待今后深入探索兩者的作用機制，為臨床提供新的治療靶點。