正交試驗(yàn)優(yōu)選超聲輔助提取南方紅豆杉醇提藥渣中多糖的工藝*

李碧淵 章可沁 謝繽瑤

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江 杭州 310006

紅豆杉是世界公認(rèn)的瀕危天然珍稀抗癌藥用植物，是提取抗癌有效化合物紫杉醇及其前體的重要來源[1]。提取得到的紫杉醇是一種抗癌活性非常強(qiáng)的紫杉烷類化合物，臨床廣泛用于治療乳腺癌、肺癌、卵巢癌、食管癌等[2]，市場需求量非常大，但在紅豆杉中含量卻非常低（0.02%～0.04%），因提取紫杉醇每年產(chǎn)生大量的南方紅豆杉藥渣，此藥渣中可能蘊(yùn)含的多種生物活性成分未能被充分利用而造成資源浪費(fèi)，這一“資源庫”亟待被開發(fā)。

迄今為止，全世界已確定了16種紅豆杉屬(Taxus)植物，中國共4種及1變種，占總儲(chǔ)量50%以上，其中以南方紅豆杉分布最為廣泛[3]。南方紅豆杉的活性成分主要包括以紫杉醇為代表的紫杉烷類化合物，以及黃酮和多糖[4-6]。目前，對(duì)其提取紫杉烷類后藥渣中黃酮苷類成分的研究已有相關(guān)報(bào)道[6]，但有關(guān)多糖的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，繼續(xù)探索南方紅豆杉醇提紫杉烷類化合物后藥渣中多糖的含量及純度，為其構(gòu)建科學(xué)的利用模式提供基礎(chǔ)研究，從而建立循環(huán)產(chǎn)業(yè)鏈，增添資源附加值。

1 儀器與試藥

1.1 儀器：Ultra-spec2100紫外分光光度計(jì)，Amersham Biosciences；LXJ-lib型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；KQ5200超聲清洗器，昆山市超聲波儀器有限公司。

1.2 藥材與試劑：南方紅豆杉（Taxus chinensis var.mairei）的帶葉枝條采自寧波紅豆杉種植基地，葡萄糖對(duì)照品（0120-9501，中國藥品生物制品檢定所）；試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 原料預(yù)處理：新鮮的南方紅豆杉帶葉枝條用剪刀剪成小段，室內(nèi)自然陰干，粉碎機(jī)將其粉碎，測含水量為5.21%，藥材粉末石油醚脫脂3次，甲醇提取紫杉烷類[4]，過濾甲醇，風(fēng)干除甲醇，得供試品。

2.2 供試品溶液制備：取供試品1.0g，加30ml水，60W超聲0.5h，提取液加活性炭脫色，過濾并定容至100ml，Sevag法除蛋白，濃縮，50ml定容，取1.0ml提取液加入到10ml塑料材質(zhì)圓底連蓋離心管，加4.0ml無水乙醇，冰箱醇沉24h，4000r·min-1離心5min，棄上清液，沉淀加2.0ml水，超聲溶解，得供試品溶液[5,7]。

2.3 方法學(xué)考察：分述如下。

2.3.1 對(duì)照品溶液制備：精密稱取干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品，加水溶解并定容，得濃度為0.996mg·ml-1的對(duì)照品溶液。

2.3.2 檢測波長選擇：精密吸取1.0ml對(duì)照品溶液置20ml具塞試管中，加1.0ml 5%苯酚和5.0ml濃硫酸，加塞搖勻室溫放置1min，沸水浴15min，冰水浴3min，室溫10min，隨行試劑為空白對(duì)照，460～520nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，選擇有最大吸收的490nm為檢測波長。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密吸取對(duì)照品溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml置試管中，每管加水補(bǔ)足1.0ml，按“2.3.2”項(xiàng)顯色，首管作空白對(duì)照，以葡萄糖濃度X為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，得到回歸方程：y=0.9381x+0.0634(r=0.9996)，對(duì)照品在 99.6～996mg·L-1內(nèi)與吸光值線性關(guān)系良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取1.0ml供試品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)顯色，每0.5h測吸光值，連續(xù)6次測定結(jié)果的RSD為1.39%，表明供試品溶液150min內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 精密度試驗(yàn)：從同一份供試品溶液中精密吸取6份，每份1.0ml，按“2.3.2”項(xiàng)顯色，測吸光值并計(jì)算含量，得RSD為2.22%，表明該法精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)：取6份1.0g的供試品，按照“2.2”項(xiàng)制備，“2.3.2”項(xiàng)顯色，測吸光值并計(jì)算含量，得RSD為3.75%，表明該法重復(fù)性較好。

2.3.7 回收率試驗(yàn)：稱取5份已知多糖含量的供試品，加等量對(duì)照品，提取，顯色并進(jìn)行含量測定，計(jì)算得到平均回收率為97.86%，RSD為1.18%。見表1。

表1 南方紅豆杉藥渣中多糖回收率試驗(yàn)測定結(jié)果（n=5）

2.4 單因素考察：分述如下。

2.4.1 料液比對(duì)多糖提取得率的影響：料液比共考察5個(gè)水平（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50），每個(gè)水平平行3份，每份1.0g供試品，60W超聲10min，重復(fù)2次，醇沉濃度為80%。不同料液比多糖的提取得率分別為（2.63±0.05）%、（2.97±0.13）%、（3.41±0.08）%、（3.67±0.07）%、（3.87±0.07）%。結(jié)果顯示，料液比越大，多糖的提取得率越高，說明增大料液比有利于加速質(zhì)量傳遞，但過大的料液比會(huì)增加后期濃縮時(shí)間和能耗，鑒于料液比大于1∶30后多糖得率增加不明顯，故選1∶30為其余因素考察項(xiàng)的料液比。

2.4.2 超聲功率對(duì)多糖提取得率的影響：超聲功率共考察5個(gè)水平（50、60、70、80、90W），每個(gè)水平平行3份，每份1.0g供試品，30倍量水，重復(fù)超聲2次，每次10min，醇沉濃度為80%。不同超聲功率多糖的提取得率分別為（2.47±0.13）%、（2.76±0.09）%、（2.69±0.04）%、（2.37±0.12）%、（1.95±0.04）%。結(jié)果顯示，超聲功率60W時(shí)多糖的提取得率最高，可達(dá)到（2.76±0.09）%，因此其余因素考察項(xiàng)的超聲功率暫定為60W。

2.4.3 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取得率的影響：超聲時(shí)間共考察5個(gè)水平（10、20、30、40、50min），每個(gè)水平平行3份，每份1.0g供試品，加30倍量水，60W超聲2次，醇沉濃度為80%。不同超聲時(shí)間多糖的提取得率分別為（1.95±0.06）%、（2.99±0.07）%、（3.44±0.09）%、（3.68±0.06）%、（3.72±0.11）%。結(jié)果顯示，30min內(nèi)，多糖提取得率隨著超聲時(shí)間增加而增加，但隨著超聲時(shí)間的延長，多糖得率增加不明顯，因此其余因素考察項(xiàng)的超聲時(shí)間定為30min。

2.4.4 超聲次數(shù)對(duì)多糖提取得率的影響：超聲次數(shù)共考察5個(gè)水平（1、2、3、4、5次），每個(gè)水平平行3份，每份1.0g供試品，加30倍量水，60W超聲，每次30min，醇沉濃度為80%。不同超聲次數(shù)多糖的提取得率分別為(2.65±0.08)%、(3.68±0.11)%、(3.84±0.07)%、(3.92±0.09)%、(4.04±0.08)%。結(jié)果顯示，超聲2次多糖得率較大，因此，正交實(shí)驗(yàn)中將超聲次數(shù)定為2次。

2.4.5 醇沉濃度對(duì)多糖提取得率的影響：醇沉濃度共考察5個(gè)水平（50%、60%、70%、80%、90%），每個(gè)水平平行3份，每份1.0g供試品，加30倍量水，60W超聲30min，重復(fù)超聲2次。不同醇沉濃度多糖的提取得率分別為(3.11±0.07)%、(3.68±0.10)%、(3.91±0.09)%、(4.04±0.08)%、(3.70±0.13)%。結(jié)果顯示，醇沉濃度80%時(shí)多糖的得率最高，因此，正交試驗(yàn)中將醇沉濃度定為80%。

2.5 正交試驗(yàn)：參考南方紅豆杉醇提藥渣中多糖提取工藝的單因素考察結(jié)果，采用正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)選提取參數(shù)[8]。選擇料液比、超聲時(shí)間和超聲功率為考察因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平（表2），不考慮交互作用，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選最佳提取工藝，每個(gè)水平平行3份，每份超聲2次，醇沉濃度為80%，結(jié)果見表3。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

表3 正交試驗(yàn)表及結(jié)果

從表3可見，影響藥渣中多糖提取得率的重要性順序?yàn)锳＞C＞B。南方紅豆杉醇提藥渣中多糖的最優(yōu)工藝為A2B2C3，根據(jù)方差分析發(fā)現(xiàn)A項(xiàng)有顯著影響（F=19.727，P＜0.05），B、C項(xiàng)則無顯著影響，確定最佳提取工藝為A2B1C1，即料液比1∶30、超聲時(shí)間20min、超聲功率50W。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)與對(duì)比試驗(yàn)：為驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，稱取30g南方紅豆杉醇提藥渣，平行3份，按上述實(shí)驗(yàn)得到的最佳提取工藝進(jìn)行提取和測定含量，測得多糖得率為3.73%，表明該法為南方紅豆杉醇提藥渣中多糖的最佳提取工藝，得率高且重現(xiàn)性良好。提取液濃縮、醇沉、烘干得多糖粗提物，計(jì)算純度為89.53%，結(jié)果見表4。此外，稱取30g南方紅豆杉生藥，平行3份，測得多糖的得率為5.12%。合并生藥提取液并按上述方式得到多糖粗提物，計(jì)算純度為70.53%，結(jié)果見表4。

表4 南方紅豆杉藥渣和生藥中多糖的得率（n=3）

3 討論

我國是全球中藥消耗量最大的國家，也是中藥藥渣產(chǎn)生最多的國家。當(dāng)前，針對(duì)藥渣已開展了一系列研究與應(yīng)用，如制成畜禽飼料、有機(jī)肥料、食用菌類栽培基料、燃料以及造紙等，但此類二次利用附加值較低[9]。

多糖含有大量羥基而具高親水性[10]，不溶于有機(jī)溶劑，南方紅豆杉醇提紫杉烷類化合物后，藥渣中可能蘊(yùn)含大量多糖，課題組前期實(shí)驗(yàn)也已證實(shí)這一情況[5]。更為重要的是，研究表明南方紅豆杉多糖具有抗腫瘤及減輕阿爾茨海默病小鼠神經(jīng)毒性和認(rèn)知功能障礙等多種生物活性[11-13]。從藥渣中繼續(xù)提取得到具有高附加值的多糖類成分，不僅是對(duì)南方紅豆杉的資源利用與保護(hù)，也為同類藥渣二次利用提供方法借鑒。

藥用植物的藥渣一般為細(xì)胞壁成分，而多糖廣泛分布于細(xì)胞壁中[7,9]，提取多糖主要是破壞或降解細(xì)胞壁。超聲波輔助提取可以改善質(zhì)量傳遞，更好地破壞細(xì)胞壁，從而加速溶劑滲透作用，參考前期實(shí)驗(yàn)，本試驗(yàn)采用超聲輔助提取[4,5]。

本試驗(yàn)優(yōu)選得到的南方紅豆杉醇提藥渣中多糖最佳提取工藝為加30倍量水，50W超聲20min。在優(yōu)化工藝條件下，南方紅豆杉醇提藥渣經(jīng)提取得到的多糖與生藥中提取得到的多糖相比，得率從5.12%下降到3.73%，純度從70.53%提高到89.53%。實(shí)驗(yàn)表明，南方紅豆杉醇提藥渣可再次提取多糖，具有較高的二次開發(fā)價(jià)值。