不同蒸制時(shí)間對三七總黃酮和多糖含量的影響

馬敏敏 朱婉萍 萬曉青

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

2 浙江省立同德醫(yī)院 浙江 杭州 310007

3 浙江醫(yī)院 浙江 杭州 310013

三七屬于五加科植物，有生、熟之分，作用有“生消熟補(bǔ)”之別。生三七功專止血祛瘀、消腫止痛，而熟三七則以補(bǔ)血、補(bǔ)氣作用較強(qiáng)。前期研究表明，蒸制是三七最常用的炮制方法，目的是使其藥材軟化，以增強(qiáng)三七的補(bǔ)益作用，緩和其藥性。研究發(fā)現(xiàn)[1]，熟三七中的總皂苷含量高于生三七；并且隨著蒸制時(shí)間的變化，三七總皂苷含量呈現(xiàn)出先升高而后逐漸降低的趨勢。本研究通過對三七不同蒸制時(shí)間的觀察，明確蒸制時(shí)間對三七總黃酮和多糖含量的影響，根據(jù)其含量差異的比較，確立三七的理想蒸制時(shí)間，為三七的炮制方法和相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考，為臨床更好地選擇三七炮制品提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設(shè)備：PerkinElmer Lambda45紫外分光光度計(jì)（美國珀金埃爾默公司）；DG120型粉碎機(jī)（浙江省瑞安市春海藥材器械廠）；DGG-9240A型立式電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；MILLI-Q SynthesisA 10純水儀（美國Millipore公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；恒溫水浴鍋 XMTE-2000型號R201D；FA 2204B電子天平（上海精科天美科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑：生三七（產(chǎn)地云南），購自于杭州華東醫(yī)藥股份有限公司藥材參茸分公司；標(biāo)準(zhǔn)對照品：葡萄糖和蘆丁均購自于中國食品藥品檢定研究院。硝酸鋁、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鈉、氫氧化鈉、濃硫酸均是分析純，5%苯酚試劑由實(shí)驗(yàn)室配置，水是自制超純水（由純水儀制備）。

2 方法與結(jié)果

2.1 三七的炮制：取300g生三七飲片，平均分成三等份，放置于100℃的蒸籠中，分別蒸制1、1.5、2h，再從籠中取出，經(jīng)晾干，打粉，再過3號篩即可[1]。

2.2 不同蒸制時(shí)間三七總黃酮含量測定：分述如下。

2.2.1 供試品溶液的制備：分別精確稱取三七粉末各100mg，經(jīng)上述“2.1”項(xiàng)處理，置于50ml錐形瓶中，精密加入25ml的70%乙醇，經(jīng)過50min超聲處理，補(bǔ)足失重，取出，離心15min（3500r/min）后，再取上清液，通過在恒溫水浴鍋內(nèi)濃縮至10ml容量瓶中，搖勻即得。

2.2.2 對照品溶液的制備：精密稱取蘆丁10.38mg，干燥至恒重，再置于25ml容量瓶中，后加70%乙醇適量，加熱于80℃水浴中，使其溶解并冷卻，用70%乙醇稀釋至刻度搖勻，即得蘆丁對照品溶液（0.415mg/ml）。

2.2.3 測定波長的確定：取5ml的蘆丁對照品溶液（0.415mg/ml)，再置于25ml容量瓶中，加1ml的5%亞硝酸鈉溶液，搖勻靜置6min，再加入1ml的10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6min后，再加入10ml氫氧化鈉溶液（1mol/L），用70%乙醇稀釋至刻度，靜置10min，確定檢測波長最大吸收波長為507.07nm，見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的最大吸收波長掃描

2.2.4 線性關(guān)系考察：精密移取0、0.5、1、2、3、4ml的對照品溶液，分別置于25ml容量瓶中，再加1ml的5%亞硝酸鈉溶液，且搖勻靜置6min，再加入1ml的10%硝酸鋁溶液，搖勻后靜置6min，再加10ml氫氧化鈉溶液（1mol/L)，用70%乙醇稀釋至刻度靜置10min，以0ml作為空白對照，在507.07nm波長處，采用分光光度法來測定吸收度，吸光度（A）作為橫坐標(biāo)，濃度（C）作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程y=0.4909x+0.0003（R2=0.9999)，說明線性關(guān)系為良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn)：同“2.2.4”項(xiàng)下方法操作，取5ml供試品溶液，重復(fù)6次測吸光度，RSD為0.210%，說明儀器精密度符合要求。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)：同“2.2.4”項(xiàng)下方法操作，取5ml供試品溶液，分別測定其在10、20、30、40、50、60min時(shí)吸光度，RSD值為1.001%。說明顯色在60min內(nèi)穩(wěn)定，符合要求。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)：取6份樣品，在同一蒸制時(shí)間下，再按供試品溶液制備的方法制備，同“2.2.4”項(xiàng)方法來測定其吸光度，RSD為3.521%，符合重復(fù)性試驗(yàn)要求。

2.2.8 樣品含量測定：精密稱取三七樣品各1000mg，在不同蒸制時(shí)間下，同“2.2.1”項(xiàng)制備供試品溶液，檢測其總黃酮含量的變化。表1提示蒸制1.5h總黃酮含量最高。

表1 在不同蒸制時(shí)間下三七總黃酮含量變化

2.3 不同蒸制時(shí)間三七多糖含量測定：分述如下。

2.3.1 供試品溶液的制備：分別精確稱取三七粉末各500mg，經(jīng)上述“2.1”項(xiàng)處理，再加水80ml，通過2h的加熱回流，經(jīng)靜置冷卻后定容至100ml容量瓶內(nèi)搖勻，通過離心后，再取上清液，精密移取上清液1ml與30ml無水乙醇，搖勻后冰箱冷凍，1h后取出，離心15min（3500r/min），丟棄清液，用熱水溶解沉淀，靜置定容至5ml容量瓶中，即得。

2.3.2 對照品溶液的制備：精密稱取9.1mg的葡萄糖，再加適量水，溶解后轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，加水至刻度線，搖勻后即得對照品，標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液濃度為91μg/ml。

2.3.3 測定波長的確定：取各0.4ml的葡萄糖對照品溶液和供試品溶液，分別靜置于25ml比色管中，再加0.6ml的水、1ml的苯酚溶液和5ml的濃硫酸，并搖勻，經(jīng)冷卻后檢測，如圖2A和圖2B所示，確定檢測波長最大吸收波長為488nm。

圖2A 供試品溶液顯色后光譜

圖2B 對照品溶液顯色后光譜

2.3.4 線性關(guān)系考察：精準(zhǔn)吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7ml，再加水補(bǔ)足至1ml，同“2.3.3”項(xiàng)方法進(jìn)行操作，在488nm處測定其吸收值，吸光度（A）作為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（C）作為橫坐，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為y=0.0649x+0.0097（R2=0.9995），表明葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度試驗(yàn)：取0.4ml的同一供試品溶液，同“2.3.4”項(xiàng)方法進(jìn)行操作，通過連續(xù)6次測定溶液的吸光度，得RSD=0.15%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別測定其在10、20、30、40、50、60min 時(shí)吸光度，計(jì)算得其 RSD=0.16%，表明樣品在1h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn)：取6份同一時(shí)間下的樣品，按照供試品溶液制備的方法制備，同“2.3.4”項(xiàng)方法操作，得總多糖的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為142.61mg/g，RSD=1.83%，結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.8 樣品含量測定：精密稱取三七粉樣品各500mg，在不同蒸制時(shí)間下，同“2.3.1”項(xiàng)制備供試品溶液，檢測其多糖含量的變化。表2提示蒸制2h多糖含量最高。

表2 在不同蒸制時(shí)間下三七多糖量變化

3 討論

中草藥三七是目前臨床較為常用的活血化瘀止血藥。目前對三七皂苷的研究較多，對三七總黃酮和多糖的研究較少。研究發(fā)現(xiàn)，生三七經(jīng)過蒸制后，多糖的含量增加，可能是因?yàn)樵碥账饷撎撬鶎?dǎo)致，而這又是補(bǔ)血作用的主要物質(zhì)，因此猜測熟三七的補(bǔ)血作用和多糖類成分有密切關(guān)系[2]。三七中的黃酮成分含有藥理活性種類較多，在抗氧化方面具有較強(qiáng)的清除自由基能力[3]。本研究發(fā)現(xiàn)蒸制后的三七中總黃酮和多糖含量是明顯高于生三七的；總黃酮含量隨著蒸制時(shí)間的變化成先升后降的趨勢，在1.5h時(shí)含量最高，在2h時(shí)含量略有下降；多糖含量隨著蒸制時(shí)間變化逐漸升高，在2h時(shí)含量最高。