產(chǎn)胡蘿卜素酵母菌的篩選

劉 悅， 王立達(dá)， 蘭 英， 李青超， 劉 洋， 趙秀梅， 楊 瑩

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 齊齊哈爾分院，黑龍江齊齊哈爾161006）

類胡蘿卜素作為一類天然色素， 其種類包括α-胡蘿卜素、隱黃質(zhì)、番茄紅素、葉黃素、玉米黃素、β-胡蘿卜素等（沈雯等，2021）。 經(jīng)過長期研究表明，類胡蘿卜素具有很多生物活性，比如抗氧化作用、預(yù)防癌癥、抗輻射、延緩衰老等，同時其可作為維生素A 的前體（包怡紅等，2020）。 植物中分布的類胡蘿卜素最為廣泛， 因此人們常常通過攝食蔬菜和水果來滿足自身對類胡蘿卜素的需求。

目前僅僅依靠天然類胡蘿卜素遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們的需求。 我國研究了利用化學(xué)合成法來生產(chǎn)胡蘿卜素， 但是這種方法不僅成本高而且技術(shù)復(fù)雜， 合成出來的胡蘿卜素不能滿足人們對其成分的要求。 而利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)胡蘿卜素有很大的應(yīng)用前景， 并且酵母菌發(fā)酵產(chǎn)胡蘿卜素有許多優(yōu)勢，例如：營養(yǎng)要求低、發(fā)酵期短、菌體營養(yǎng)豐富、發(fā)酵條件易于控制等（吳園園等，2020；馬田等，2019；孫玉敬等，2012）。 近年來， 在研究利用微生物生產(chǎn)類胡蘿卜素方面越來越多樣化，除了經(jīng)常用的三孢布拉霉菌、紅酵母之外，還有環(huán)黑星霉、環(huán)孢霉也可以用于生產(chǎn)類胡蘿卜素， 目前對其他菌種的合成研究還是比較少， 對其生物合成的遺傳學(xué)研究也鮮見報 道 （Saini 等，2017；Hernández-Almanza 等，2016）。 因此需要進(jìn)一步探索和開發(fā)合成胡蘿卜素的方法。 本研究從土壤中篩選胡蘿卜素高產(chǎn)的酵母菌株， 用定量分析的方法確定胡蘿卜素的產(chǎn)量，并對搖床發(fā)酵條件進(jìn)行初步優(yōu)化，為今后胡蘿卜素的生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料 土樣采集于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院齊齊哈爾分院科研試驗基地園區(qū)中的土壤。

1.2 試驗試劑及培養(yǎng)基 以下培養(yǎng)基配方中所用試劑均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

沙氏培養(yǎng)基：稱取7.5 g 的沙氏培養(yǎng)基溶解到含有150 mL 蒸餾水的搪瓷缸內(nèi)，加熱煮沸，待冷卻后，分裝入250 mL 錐形瓶內(nèi)，各裝30 mL，115 ℃，滅菌15 min。

PDA 培養(yǎng)基：稱取34.5 g 的PDA 培養(yǎng)基溶解到含有750 mL 蒸餾水的搪瓷缸內(nèi)，加熱煮沸，待冷卻后，分裝入500 mL 的錐形瓶中，115 ℃，滅菌15 min。

SDAY 培養(yǎng)基： 稱取60 g 的SDAY 培養(yǎng)基溶解到含有750 mL 蒸餾水的搪瓷缸內(nèi)，加熱煮沸，待冷卻后，分裝入500 mL 的錐形瓶中，121 ℃，滅菌20 min。

斜面培養(yǎng)基： 稱取4.6 g 的PDA 培養(yǎng)基溶解到含有100 mL 蒸餾水的搪瓷缸內(nèi)，加熱煮沸，待冷卻后，分裝入10 支試管內(nèi)，每個試管中加入5 mL，121 ℃，滅菌20 min。

YPD 培養(yǎng)基： 稱取2 g 葡萄糖，2 g 蛋白胨，1 g酵母浸粉溶解到含有100 mL 蒸餾水的搪瓷缸內(nèi)，加熱煮沸，待冷卻后，分裝入250 mL 的錐形瓶中， 每個錐形瓶中放入30 mL 培養(yǎng)基，121 ℃，滅菌20 min。

1.3 試驗方法

1.3.1 采集樣品 本試驗樣品來源于營養(yǎng)豐富、微生物較多的土壤。根據(jù)土壤營養(yǎng)的豐富程度，采集地表下10 ~ 15 cm 處的樣品。

1.3.2 富集培養(yǎng) 在無菌操作臺中， 取5 g 的土壤樣品置于含有50 mL 無菌水和十幾個玻璃珠的250 mL 錐形三角瓶中， 振蕩10 min 后靜置片刻，取懸浮液5 mL 接種于沙氏液體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基放入到28 ℃，150 r/min 的搖床中，進(jìn)行富集培養(yǎng)24 h。

1.3.3 稀釋涂布與劃線分離 將富集培養(yǎng)過的原始菌液梯度稀釋，并均勻涂布在PDA 和SDAY 培養(yǎng)基表面，在生化培養(yǎng)箱中生長3 ~ 5 d 后，將平板中的紅色或橙紅色、 橙黃色的菌落進(jìn)行劃線分離。

1.3.4 種子培養(yǎng)與搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 在無菌操作臺中， 挑取劃線分離的單菌落接種到含有30 mL YPD 液體培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中， 培養(yǎng)的溫度為28 ℃， 搖床速度為150 r/min， 培養(yǎng)至對數(shù)期。 達(dá)到對數(shù)期的菌株以10%的接種量接種到含有30 mL YPD 液體培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，在28 ℃，150 r/min 的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)72 h。

1.3.5 酵母菌生物量的測定 將發(fā)酵培養(yǎng)后的菌液分裝到10 mL 的離心管（m）中。4000 r/min 離心15 min，棄去上液清，然后用無菌水洗滌菌體沉淀兩次， 并在50 ~ 60 ℃下干燥至恒重， 稱量重量M。 求得酵母菌生物量W，公式如下：

W/（g/L）=（M-m）×100。

1.3.6 胡蘿卜素的抽提 參考Kim （2010） 的方法。 將二甲基亞砜在55 ℃水浴中預(yù)熱5 min，向離心洗滌后的菌體中加入10 mL 預(yù)熱后的二甲基亞砜， 在65 ℃的水浴鍋中進(jìn)行20 min 破壁處理，期間每3 min 用漩渦振蕩器一次，以增強(qiáng)破壁效果。 然后加入二甲基亞砜3 倍量的丙酮（30 mL），黑暗中提取30 min，并每隔5 min 用漩渦振蕩器振蕩。然后4000 r/min 離心15 min。收集色素上清液，重復(fù)提取過程直至菌體變?yōu)榘咨?/p>

1.3.7 胡蘿卜素的定性、 定量分析 采用分光光度法將色素浸提液在380 ~ 700 nm 波長下進(jìn)行全波長掃描，確定最大吸收波長，并對該菌種特征吸收峰進(jìn)行光譜分析。 開始波長700 nm，結(jié)束波長380 nm，掃描速度中速。 總胡蘿卜素含量的測定參考馬家麗（2015）方法進(jìn)行計算。

總胡蘿卜素含量/（μg/g）=（A×D×V）/0.16m；

式中：A 為總胡蘿卜素最大吸收波長下的吸光度；D 為測定試樣時的稀釋倍數(shù)；V為提取所用溶液的體積，mL；0.16 為胡蘿卜素的摩爾消光系數(shù)，L/mg；m為酵母菌的菌體質(zhì)量，g。

胡蘿卜素產(chǎn)量/（mg/L）=生物量（g/L）×胡蘿卜素含量（mg/g）。

采用高效液相色譜技術(shù)， 根據(jù)不同組分及標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間與光譜吸收值相結(jié)合的方法對色素提取液進(jìn)行定性與定量分析。色素提取液進(jìn)樣前需用0.45 μm 的微孔濾膜去除雜質(zhì)； 流動相：A：90%乙腈；B：100%乙酸乙酯；梯度洗脫：0 ~ 5 min，B 從0 升至50%；5.01 min，B 升至53%；5.01 ~l0 min，B 保 持 在53%；10 ~ 15.01 min，B 升 至54%；15.01 ~ 20 min，B 升至55%；20.01 min，B 升至56%；20.01 ~ 30 min，B 從56%升至57%；30 ~35 min，B 降為0；流速l mL/min；進(jìn)樣量20 μL；檢測波長450 nm（周鮮嬌等，2009）。 標(biāo)準(zhǔn)品測定方法同上。

1.3.8 培養(yǎng)基無機(jī)鹽組分單因素試驗設(shè)計 取一環(huán)活化過的單菌落接種到含有30 mL YPD 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，將達(dá)到對數(shù)生長期的菌種以10%的接種量接種到含有30 mL YPD 液體培養(yǎng)基中，分別添加不同濃度的KH2PO4（0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 g/L）， MgSO4（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L），NaCl （0.1、0.15、0.2、0.25、0.3g/L）（唐 棠 等，2011），振蕩培養(yǎng)72 h。

1.3.9 正交試驗優(yōu)化設(shè)計 根據(jù)無機(jī)鹽的單因素試驗，KH2PO4、MgSO4、NaCl 對酵母菌發(fā)酵胡蘿卜素有影響，且影響均為正效應(yīng)。以基礎(chǔ)的培養(yǎng)液為對照，采用三因素三水平的正交試驗設(shè)計方案（表1），進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基組成（馬歌麗等，2015）。

表1 正交試驗g/L

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 利用SPSS 20 對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選的結(jié)果

2.1.1 菌種在PDA 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài) 總共采集35 個土樣，經(jīng)過篩選、觀察、分離純化，在培養(yǎng)基上劃線分離培養(yǎng)后的菌落形態(tài)， 總共得到7種酵母菌，菌落顏色及形態(tài)如表2。

表2 酵母菌在PDA 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

2.1.2 酵母菌顯微結(jié)構(gòu)圖 圖1 為酵母菌制片在100×倍顯微鏡下觀察的結(jié)果，可以看出酵母菌的細(xì)胞較大，并且均處于出芽狀態(tài)，這是典型的酵母菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

圖1 酵母菌顯微結(jié)構(gòu)圖

2.2 采用分光光度法對類胡蘿卜素進(jìn)行光譜測定 由圖2 可知， 在490 nm 處有一個最高的吸收峰，其兩側(cè)還有兩個吸收峰，出現(xiàn)胡蘿卜素典型的三指吸收峰。 因此得出所篩選的7 種酵母菌株所產(chǎn)色素為胡蘿卜素，并且其中有一種為β-胡蘿卜素。 從表3 中可以看出所篩選菌株編號為21-1、33-2、22-1、27-1、25-1、17-1、25-2，產(chǎn)量分別為7.42、7.28、7.26、7.08、6.30、5.53、3.28 mg/L。 其中產(chǎn)量最高的菌株，編號為21-1，產(chǎn)量為7.42 mg/L。

表3 胡蘿卜素產(chǎn)量

圖2 提取色素的掃描光譜

2.3 無機(jī)鹽對酵母菌產(chǎn)胡蘿卜素的影響

2.3.1 無機(jī)鹽組分單因素對酵母菌產(chǎn)胡蘿卜素的影響 為提高胡蘿卜素的產(chǎn)量， 對篩選出的編號21-1 的酵母菌培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。 以YPD 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基并作空白對照， 分別添加不同濃度的無機(jī)鹽，結(jié)果表明，隨著KH2PO4質(zhì)量濃度的增加，胡蘿卜素的產(chǎn)量呈先上升后下降的趨勢，在KH2PO4質(zhì)量濃度為0.6 g/L 時， 胡蘿卜素的產(chǎn)量達(dá)到最大，產(chǎn)量值為8.23 mg/L。 對于無機(jī)鹽Mg-SO4的添加結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 隨著MgSO4質(zhì)量濃度的增加， 胡蘿卜素的產(chǎn)量呈先上升后下降的趨勢，在MgSO4質(zhì)量濃度為0.4 g/L 時，胡蘿卜素的產(chǎn)量達(dá)到最大，產(chǎn)量值為7.72 mg/L。而對于添加NaCl 的結(jié)果表明，隨著NaCl 質(zhì)量濃度的增加，胡蘿卜素的產(chǎn)量呈先上升后下降的趨勢，在NaCl 質(zhì)量濃度為0.2 g/L 時，胡蘿卜素的產(chǎn)量達(dá)到最大，產(chǎn)量值為7.61 mg/L（圖3）。

圖3 無機(jī)鹽對酵母菌產(chǎn)胡蘿卜素的影響

2.3.2 正交試驗對酵母菌產(chǎn)胡蘿卜素的影響 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取最大產(chǎn)量質(zhì)量濃度的無機(jī)鹽0.6 g/L 的KH2PO4；0.4 g/L 的MgSO4；0.2 g/L的NaCl，以這三個濃度的無機(jī)鹽為中心點，各無機(jī)鹽取三個濃度進(jìn)行正交試驗。

正交試驗結(jié)果表明， 三種無機(jī)鹽對胡蘿卜素的產(chǎn)量影響順序為A>C>B， 即KH2PO4是影響酵母菌生產(chǎn)胡蘿卜素的主要因素， 其次為NaCl，最后是MgSO4。從表4 中可以看出，胡蘿卜素的最高產(chǎn)量為8.55 mg/L， 其相應(yīng)的各因素組合為A1B2C2， 即0.5 g/L KH2PO4、0.4 g/L MgSO4、0.2 g/L NaCl。 這時與最初的酵母菌產(chǎn)量相比較， 提高了15.3%。

表4 正交試驗結(jié)果與分析

2.4 高效液相色譜法測定類胡蘿卜素組分與含量 由圖4 可知，β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間為13.335，所篩選菌種的產(chǎn)物中有一種組分在此附近都有出峰， 因此確定產(chǎn)物中有一種是β-胡蘿卜素。根據(jù)出峰面積可以看出β-胡蘿卜素產(chǎn)量，按從高到低依次是25-1、21-1、27-1、25-2、17-1、22-1。

圖4 各菌株的類胡蘿卜素組分與含量

3 討論

胡蘿卜素作為一種天然色素， 已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域。經(jīng)過長期研究它的生物活性，了解到其功能對人體會產(chǎn)生大量的益處。 但是天然胡蘿卜素遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足我國人口的需求， 所以需要通過其他方法進(jìn)行批量生產(chǎn)胡蘿卜素。 本試驗探討的是，通過酵母菌生產(chǎn)胡蘿卜素。酵母菌細(xì)胞形態(tài)一般呈現(xiàn)圓形、球形及圓柱形等，多數(shù)呈出芽繁殖（馬偉東等，2020）。本研究經(jīng)分離純化篩選出7 株酵母菌，菌株顏色較多偏紅色，菌株形態(tài)以圓形為主，結(jié)合顯微鏡觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酵母菌細(xì)胞處于出芽狀態(tài)，這是典型的酵母菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

采用分光光度法對類胡蘿卜素進(jìn)行光譜測定發(fā)現(xiàn)，在490 nm 處有一個最高的吸收峰，其兩側(cè)還有兩個吸收峰，出現(xiàn)胡蘿卜素典型的三指吸收峰，得出所篩選的7 種酵母菌株所產(chǎn)色素為胡蘿卜素。 這與劉月英（2000）研究結(jié)果類似，利用分光光度法對胡蘿卜素吸收峰測定，并與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對照，同時也發(fā)現(xiàn)酵母菌株吸收光譜的測定與菌株的培養(yǎng)條件以及色素提取、測定條件密切相關(guān)。 另外，在研究無機(jī)鹽組分單因素對酵母菌產(chǎn)胡蘿卜素的影響中發(fā)現(xiàn)，隨著KH2PO4質(zhì)量濃度的增加，胡蘿卜素的產(chǎn)量逐步提高，在0.6 g/L 時到達(dá)最大，然后產(chǎn)量會發(fā)生驟減。 產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是KH2PO4質(zhì)量濃度太高，破壞了細(xì)胞的滲透壓，有部分酵母菌可能發(fā)生死亡（吳雪君等，2020）。 此外研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無機(jī)鹽KH2PO4對酵母菌產(chǎn)胡蘿卜素的影響最為明顯，MgSO4、NaCl 其次。徐軍（2003）在研究無機(jī)鹽對青霉PT95 菌株產(chǎn)類胡蘿卜素影響時發(fā)現(xiàn)， 無機(jī)鹽KH2PO4的添加對類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響效果最好。同時，三種無機(jī)鹽正交試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后， 與最初的酵母菌產(chǎn)量相比較， 提高了15.3%。 有研究表明無機(jī)鹽KH2PO4、MgSO4、NaCl 的添加使酵母菌產(chǎn)胡蘿卜素的產(chǎn)率提高，并且本研究影響因素的整體趨勢與前人基本保持一致（葉雙明等，2020；丁長河等，2019；張磊，2017；張穎鑫等，2010）。 另從所篩選出的菌株高效液相色譜圖發(fā)現(xiàn)，與β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜特征吸收峰比較，β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間為13.335 min， 所篩選菌種的產(chǎn)物中有一種組分在此附近都有出峰，可以初步判定色素粗提液中含有β-胡蘿卜素，后續(xù)試驗將會繼續(xù)驗證，同時也會利用基因工程方法對篩選出的酵母菌進(jìn)行基因敲除等研究，為今后胡蘿卜素的開發(fā)與生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本試驗通過紫外掃描結(jié)果看出色素提取物具有胡蘿卜素典型的三指吸收峰， 共篩選出7 株符合試驗要求，篩選菌株所產(chǎn)生的色素為胡蘿卜素。所篩選菌株編號為21-1、33-2、22-1、27-1、25-1、17-1、25-2， 產(chǎn) 量 分 別 為7.42、7.28、7.26、7.08、6.30、5.53、3.28 mg/L。 其中產(chǎn)量最高的菌株，編號為21-1，產(chǎn)量為7.42 mg/L。 對此菌株進(jìn)行無機(jī)鹽組分單因素試驗和正交試驗的初步優(yōu)化， 優(yōu)化后21-1 菌株胡蘿卜素產(chǎn)量為8.55 mg/L， 相比初篩的菌種提高了15.3%。 將這7 株菌株產(chǎn)胡蘿卜素的特征吸收峰與β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)所篩選菌種的產(chǎn)物中有一種組分色素粗提液中含有β-胡蘿卜素，為獲得具有開發(fā)應(yīng)用價值的產(chǎn)胡蘿卜素的酵母菌株奠定理論基礎(chǔ)。