基于形態(tài)學(xué)與SSR標(biāo)記的甘薯種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

齊張華 李 丹 姚曉文 張銀東 歐文軍

（1.海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海南 ?？?570208；2.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，海南 ?？?570208； 3.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 ?？?570208）

0 引言

甘 薯［（Lour.）Burkill.］作為重要的糧食作物，在能源、飼料產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用廣泛，其適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高?！笆奈濉睍r(shí)期以來(lái)，糧食安全的重要性日益突出。為打好種業(yè)翻身仗，加強(qiáng)農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源挖掘成為研究熱點(diǎn)。種質(zhì)資源是品種改良的基礎(chǔ)和保障，種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用是甘薯遺傳多樣性拓展的重要途徑。筆者利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記和SSR分子標(biāo)記對(duì)大量甘薯品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析，以期為甘薯種植資源的挖掘和利用奠定基礎(chǔ)。

甘薯種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)與標(biāo)記鑒定分析息息相關(guān)，與甘薯遺傳多樣性的問(wèn)題密切關(guān)聯(lián)。遺傳標(biāo)記是遺傳多樣性分析的手段。遺傳標(biāo)記除了經(jīng)典的形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記和蛋白質(zhì)標(biāo)記外，還有不同類型的分子標(biāo)記，目前常見(jiàn)的分子標(biāo)記類型主要有基于Southern雜交的標(biāo)記、基于PCR的標(biāo)記、基于重復(fù)序列的標(biāo)記、mRNA為基礎(chǔ)的標(biāo)記及單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記5種類型。

因此，筆者利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記和SSR分子標(biāo)記對(duì)多份甘薯材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析，以期挖掘優(yōu)異的甘薯種質(zhì)材料，為今后甘薯品種選育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選取海南省文昌馮坡基地種植的144份甘薯材料作為研究對(duì)象。材料來(lái)源以國(guó)內(nèi)資源為主，其中福建省18份，廣東省15份，重慶市11份，江蘇省10份，山東省和四川省各9份，浙江省8份，廣西壯族自治區(qū)7份，河北省5份，河南省4份，海南省3份，安徽省、湖北省、陜西省和貴州省各2份，吉林省、湖南省、江西省、臺(tái)灣地區(qū)各1份，地方品種1份（未知具體來(lái)源）；國(guó)外品種18份，分別來(lái)源于日本、美國(guó)及南美地區(qū)；未知來(lái)源品種14份。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及性狀調(diào)查

144個(gè)甘薯品種均植于文昌馮坡基地，各品種采用隨機(jī)區(qū)組排列的方法種植。對(duì)甘薯株型、頂葉色、葉片形狀、葉緣類型、葉缺刻類型、葉色、葉脈色、脈基色、柄基色、莖端茸毛、莖主色、莖次色、基部分枝和主蔓長(zhǎng)14個(gè)地上部性狀及薯形、薯皮主色和薯肉主色3個(gè)地下部性狀，共17個(gè)性狀進(jìn)行調(diào)查。每個(gè)品種至少設(shè)置5個(gè)生物學(xué)重復(fù)，參照植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南——《甘薯種質(zhì)資源描述規(guī)范》（NY/T 2939—2016）對(duì)甘薯表型進(jìn)行賦值。

1.3 SSR標(biāo)記方法

采用李強(qiáng)等改良后的CTAB方法提取甘薯葉片基因組DNA。每個(gè)品種各隨機(jī)選取3株，統(tǒng)一取莖尖第一片展開(kāi)葉。根據(jù)品種系譜關(guān)系及來(lái)源地不同選取了4個(gè)甘薯品種為DNA模板，利用本實(shí)驗(yàn)室依據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)了100對(duì)引物，利用PAGE電泳對(duì)其進(jìn)行了篩選，最終獲得了28對(duì)可獲得清晰條帶且具有多態(tài)性的引物，用于后續(xù)的SSR分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。根據(jù)PAGE電泳結(jié)果讀取條帶，清晰的記錄為“1”，沒(méi)有條帶的記錄為“0”，構(gòu)建“01”數(shù)據(jù)表。將“01”數(shù)據(jù)導(dǎo)入DPS系統(tǒng)中，計(jì)算品種間的Nei氏遺傳距離，將遺傳距離數(shù)據(jù)導(dǎo)入MEGA11中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，利用iTOL在線工具對(duì)發(fā)育樹(shù)修飾美化。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用DPS軟件對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行主成分和聚類分析。利用DPS軟件對(duì)表型性狀賦值后的結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)化，進(jìn)行主成分分析，并計(jì)算Nei氏遺傳距離，將材料間的遺傳距離數(shù)據(jù)導(dǎo)入MEGA11，采用類平均法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行聚類分析，并采用在線iTOL工具美化。

2 結(jié)果與分析

2.1 144個(gè)甘薯品種表型性狀的主成分分析與聚類分析

基于表型標(biāo)記，對(duì)144個(gè)品種進(jìn)行主成分分析，主成分1～7特征值分別為3.507 7、2.074 6、1.800 0、1.566 2、1.330 3、1.059 2和1.019 1，貢獻(xiàn)率分別為20.633 8%、12.203 3%、10.588 4%、9.212 8%、7.825 3%、6.230 4%和5.994 6%，累計(jì)貢獻(xiàn)率分別為20.633 8%、32.837 1%、43.425 4%、52.638 3%、60.463 6%、66.694 0%和72.688 5%。結(jié)果顯示，在19個(gè)變量因子中，7個(gè)主成分的特征值大于1，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)72.69%，即7個(gè)變量因素可以解釋表型差異的72.69%，主成分1和2分別解釋表型差異的20.63%和12.21%。其中，主成分1主要反映脈色、脈基色、柄基色3個(gè)性狀，主成分2主要反映葉片形狀、葉緣類型、葉缺刻類型3個(gè)性狀，主成分3主要反映薯皮色性狀，主成分4主要反映株型和蔓長(zhǎng)性狀，主成分5主要反映葉色和頂葉色，主成分6主要反映薯形和基部分枝，主成分7主要反映薯皮色和葉形。

主成分1和主成分2直觀反映了地上部性狀，可以解釋表型差異的32.84%。從主成分分析圖中也可以看出，材料之間并沒(méi)有明確的分群，差異不大（見(jiàn)圖1）。

圖1 基于表型性狀的主成分分析圖

2.2 144個(gè)甘薯品種的Nei氏遺傳距離分析

利用DPS軟件計(jì)算144個(gè)甘薯品種的Nei氏遺傳距離，遺傳距離在0.326～0.364，平均遺傳距離為0.345。從品種來(lái)源地看，144個(gè)甘薯品種中，北方薯區(qū)品種29個(gè)、南方薯區(qū)品種44個(gè)、長(zhǎng)江中下游夏薯區(qū)品種16個(gè)、西南薯區(qū)品種22個(gè)、國(guó)外品種18個(gè)，未知來(lái)源品種15個(gè)。其中，北方與長(zhǎng)江流域薯區(qū)品種間的遺傳距離最大，為0.364；南方薯區(qū)與國(guó)外品種之間的距離最小，為0.326（見(jiàn)表1）?？偟膩?lái)說(shuō)，不同薯區(qū)之間品種基因存在差異，但是遺傳多樣性不太豐富，說(shuō)明各薯區(qū)之間以及國(guó)內(nèi)外甘薯品種之間存在明顯的基因交流。圖2為不同薯區(qū)品種基于非加權(quán)組平均法（Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic means，UPGMA）的聚類分析圖，可以直觀明確地反映出各區(qū)之間的遺傳差異。

圖2 基于表型性狀144個(gè)甘薯品種的聚類圖

表1 不同地區(qū)品種間的遺傳距離

2.3 基于SSR標(biāo)記對(duì)甘薯品種進(jìn)行聚類分析

利用品種的Nei氏遺傳距離構(gòu)建110個(gè)品種的聚類圖。110個(gè)品種在遺傳距離為0.022 1處分為3個(gè)類群，遺傳距離0.048 9處將第3類群分為兩個(gè)亞群，分別為Ⅲ-1和Ⅲ-2。第Ⅰ類群有22個(gè)品種、第Ⅱ類群有42個(gè)品種、第Ⅲ類群有46個(gè)品種。從品種來(lái)源看，國(guó)外品種大部分聚類在第Ⅲ類群的第二亞群中，占比達(dá)72%。另外，該亞群南方品種較多，反映出南方品種與國(guó)外的品種親緣關(guān)系較近，未知來(lái)源的品種也聚類在該亞群?？偟膩?lái)說(shuō)，來(lái)源地相近的品種有聚在一起的趨勢(shì)，即這些品種的遺傳差異較小。品種的詳細(xì)聚類情況見(jiàn)圖3。

圖3 110份甘薯材料的聚類分析

2.4 核心種質(zhì)庫(kù)的構(gòu)建

筆者以SSR（0,1）數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，利用Core Hunter軟件從110個(gè)甘薯品種中初步獲得18個(gè)核心種質(zhì)，分別是瓦爾圖努2號(hào)、紅尾薯、福薯404、紅優(yōu)、紫云薯、廣紫薯2號(hào)、S1-5、渝薯17、W554、花紫、南紫薯014、冀薯4、徐薯32、六十日、紫葉2號(hào)、桂經(jīng)9號(hào)、抗旱薯和鶯歌。從來(lái)源地來(lái)看，來(lái)自國(guó)外品種2個(gè)，來(lái)自福建省1個(gè)品種，重慶市2個(gè)品種，廣西壯族自治區(qū)1個(gè)品種，廣東省2個(gè)，江蘇省、貴州省、四川省、河北省、臺(tái)灣地區(qū)各1個(gè)品種，5個(gè)為來(lái)源未知的品種。

3 討論

表型性狀是基因修飾與環(huán)境互作影響的產(chǎn)物，可以直觀地反映作物品種之間的遺傳差異。通過(guò)功能基因組的挖掘和分析，各學(xué)者還在不斷發(fā)掘新的、更多的形態(tài)學(xué)標(biāo)記。目前，部分作物表型數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)建成，并且還在不斷更新中。因此，基于表型的遺傳多樣性分析是有意義的。

筆者利用17個(gè)表型數(shù)據(jù)，對(duì)144份材料進(jìn)行了分析，降維獲得了7個(gè)無(wú)關(guān)聯(lián)的主成分。其中，主成分1主要反映葉脈色、脈基色、柄基色3個(gè)性狀，主成分2主要反映葉片形狀、葉緣類型、葉缺刻類型3個(gè)性狀，主成分3主要反映薯皮色性狀，主成分4主要反映株型和蔓長(zhǎng)性狀，主成分6主要反映薯形和基部分枝，主成分7反映薯皮色和葉形。地上部性狀差異豐富，表型之間有關(guān)聯(lián)關(guān)系，如主成分1表現(xiàn)出莖葉性狀與地下部性狀及株型呈明顯的負(fù)相關(guān)。通過(guò)這些相關(guān)性，可以為不同育種目的甘薯選育提供參考依據(jù)。

基于表型性狀的聚類分析結(jié)果顯示，第Ⅰ、Ⅲ族群各只包含一個(gè)品種，分別是瓦爾圖努2號(hào)和福建武平農(nóng)家種，兩個(gè)材料表型獨(dú)特，可以作為重點(diǎn)材料在今后的育種研究中加以應(yīng)用。另外，筆者發(fā)現(xiàn)，聚類的結(jié)果與品種來(lái)源地?zé)o明顯關(guān)聯(lián)，這可能與環(huán)境的干預(yù)、調(diào)查的主觀性有關(guān)。因此，要想進(jìn)一步對(duì)品種加以利用，就需要進(jìn)一步從分子層面進(jìn)行鑒定分析，即基于分子標(biāo)記的分析。

經(jīng)過(guò)對(duì)不同薯區(qū)的品種進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)各薯區(qū)遺傳距離在0.326～0.364，平均遺傳距離為0.345。其中，北方薯區(qū)與長(zhǎng)江流域薯區(qū)品種間的遺傳距離最大，為0.364；南方薯區(qū)與國(guó)外品種間的遺傳距離最小，為0.326。該結(jié)果反映出南方薯區(qū)與國(guó)外品種遺傳差異較小，佐證了甘薯由海路傳入我國(guó)，即甘薯首先在南方種植，然后向全國(guó)傳播開(kāi)來(lái)。該結(jié)果與高閏飛的結(jié)論有所不同。高閏飛利用SSR標(biāo)記分析了中國(guó)育成紫心甘薯的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)國(guó)外品種綾紫與西南薯區(qū)的親緣關(guān)系較近，但該結(jié)果佐證了甘薯傳入中國(guó)的另一條路線，即由陸路從印度、緬甸傳入我國(guó)西南地區(qū)。

相同品種采用不同的標(biāo)記方法進(jìn)行的聚類分析結(jié)果并不完全相同，基于SSR分子標(biāo)記對(duì)甘薯品種進(jìn)行聚類分析的結(jié)果與基于表型標(biāo)記的聚類分析結(jié)果雖然在分類上大體是一致的，但是各品種的聚類分布情況卻不盡相同，這可能與表型受基因與環(huán)境互作結(jié)果的影響有關(guān)。從聚類分布來(lái)看，對(duì)比兩種不同的標(biāo)記方法來(lái)看，有少部分品種分在了不同的類群。從品種來(lái)源看，國(guó)外品種大部分聚類在第Ⅴ類群的第二亞群中，Ⅴ-2亞群13個(gè)，占比達(dá)72%。另外，該亞群南方品種較多，該結(jié)果也反映出南方品種與國(guó)外的品種親緣關(guān)系較近。該結(jié)果與Anglin等的結(jié)果有一定的差異，其分析了來(lái)自CIP的5 979份甘薯種質(zhì)，結(jié)果顯示甘薯發(fā)源地所在地中南美洲的幾個(gè)國(guó)家，種質(zhì)資源非常獨(dú)特，而其他地區(qū)，如澳洲、非洲、亞洲等地的品種，明顯有遺傳交流的痕跡，特別是來(lái)自中國(guó)的品種。二者結(jié)果均表明，來(lái)源地相近的品種有聚在一起的趨勢(shì)，即這些品種的遺傳差異較小。另外，國(guó)內(nèi)這些品種的遺傳差異較小，因此，應(yīng)該加大對(duì)國(guó)外品種的引進(jìn)，來(lái)擴(kuò)大國(guó)內(nèi)品種的多樣性。

筆者利用Core Hunter軟件從110個(gè)甘薯品種中初步獲得18個(gè)核心種質(zhì)，從來(lái)源地來(lái)看，來(lái)源未知的品種是最多的。因此，筆者建議加強(qiáng)對(duì)這些未知來(lái)源品種的鑒定保護(hù)和利用。趙路寬基于SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)，借助Core Hunter軟件已構(gòu)建了甜菜、甘薯的核心種質(zhì)。因此，筆者利用該法構(gòu)建核心種質(zhì)庫(kù)是可行的。

4 結(jié)論

筆者基于形態(tài)學(xué)和SSR分子標(biāo)記對(duì)多個(gè)甘薯種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，具體結(jié)論如下。

①利用17個(gè)表型性狀，其中14個(gè)地上部性狀和3個(gè)地下部性狀，對(duì)144份甘薯材料進(jìn)行主成分和聚類分析。主成分分析結(jié)果顯示，有7個(gè)主成分的特征值大于1，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)72.69%，主成分1和主成分2直觀反映了地上部性狀，可以解釋表型差異的32.84%；聚類分析顯示，144份的甘薯材料在遺傳距離0.198 2處，劃分為5個(gè)族群，遺傳距離0.298 8處將第Ⅴ族群分為兩個(gè)亞群（V-1、V-2）。其中瓦爾圖努2號(hào)和福建武平農(nóng)家種，兩個(gè)材料表型獨(dú)特，可以在今后的甘薯育種中作為親本材料。從品種來(lái)源看，國(guó)外品種大部分聚類在第Ⅴ類群的第二亞群中；該亞群南方品種較多，反映出南方品種與國(guó)外的品種親緣關(guān)系較近。②聚類分析結(jié)果顯示，144份甘薯材料均可以分為5個(gè)類群，兩者結(jié)果一致，總的來(lái)說(shuō)，來(lái)源地相近的品種有聚在一起的趨勢(shì)，即這些品種的遺傳差異較小，可以為甘薯遺傳育種及種質(zhì)創(chuàng)制提供指導(dǎo)。