基于代謝組學(xué)的黑老虎果實發(fā)育過程中花青苷組分動態(tài)分析

覃艷紅，明如宏，姚紹嫦，2，譚 勇，2，黃 鼎，2*

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)壯瑤藥重點實驗室，廣西 南寧 530200）

黑老虎Kadsura coccinea（Lem.）A.C.Smith是木蘭科南五味子屬藤本植物，原生于我國西南部原始森林。其果形奇特，部分品種果實富含花青苷，營養(yǎng)與藥用價值高，集食用、觀賞、美化、綠化及藥用于一體［1］。其根可藥用，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明黑老虎根中的木脂素和三萜類物質(zhì)具有多種藥理活性，如抗癌、抗HIV、抗氧化等作用［2-5］；果實中富含人體所必需的多種氨基酸、礦質(zhì)元素和微量元素，且維生素C和花青苷含量較高，具有良好的保健價值［6-8］；此外，黑老虎的種子也具有一定的食品開發(fā)利用價值［9］。因此，黑老虎是一種具有多開發(fā)用途的特色藥用植物，其種植產(chǎn)業(yè)可作為當?shù)剞r(nóng)民增收、脫貧致富的特色支柱產(chǎn)業(yè)，具有非常好的開發(fā)利用價值和發(fā)展前景。

黃酮類物質(zhì)是植物中主要的一類次級代謝產(chǎn)物，普遍存在于水果、蔬菜等園藝作物中。按照其化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為4大類：黃烷酮、黃酮、黃酮醇和花青苷［10］?；ㄇ嘬帐菍儆陬慄S酮類的水溶性次生代謝物質(zhì)，通過糖苷鍵以糖苷形式存在于植物的液泡中，賦予了眾多園藝作物從紅色、藍色到紫色的各種色彩變化［11-13］。花青苷是一種非常有效的天然抗氧化物，它能有效猝滅自由基，在抵御心血管疾病、預(yù)防癌癥和一些其他的慢性病、改善血液循環(huán)等方面有重要意義［14-17］。同時花青苷作為一種天然食用色素，資源豐富，提取工藝成熟，在醫(yī)藥、食品、化妝行業(yè)有著重要的應(yīng)用［18-20］。

迄今為止，關(guān)于黑老虎的研究主要集中在藥效成分、藥理作用和種質(zhì)資源遺傳多樣性上［21-24］，而果實中花青苷組分與含量尚未見有報道。本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）方法，分析黑老虎果實發(fā)育中花青苷的組分與含量的動態(tài)變化，為黑老虎果實花青苷的研究和開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 材料與試劑 黑老虎果實來源于廣西南寧市邕寧區(qū)廣澤農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司種植基地，三個果實發(fā)育時期分別為幼果期（S1）、轉(zhuǎn)色期（S2）和著色期（S3）。甲醇（色譜純，德國Merck公司）；甲酸（色譜純，美國Sigma-Aldrich公司）；鹽酸（優(yōu)級純，信陽市化學(xué)試劑廠）。

1.2 儀器與設(shè)備 QTRAP 6500+液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國SCIEX公司）；5424R離心機（德國Eppendorf公司）；MM400球磨儀（德國Retsch公司）；KQ5200E超聲清洗儀（昆山舒美公司）。

2 方法

2.1 樣本前處理 黑老虎果實樣品真空冷凍干燥：利用球磨儀研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末狀；取50 mg的樣品粉末，溶解于500μl 50%的甲醇水溶液（含0.1%鹽酸）中；渦旋10min，超聲10min，離心（轉(zhuǎn)速12000r/min，3 min），吸取上清，重復(fù)操作1次；合并兩次上清液，用微孔濾膜（0.22μm）過濾樣品，并將過濾液保存于進樣瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。每個果實發(fā)育時期取5個果實研磨后混勻作為一個樣品，每個時期設(shè)置3個平行實驗。

2.2 總花青苷含量測定 總花青苷含量測定采用pH示差法［25］。具體操作如下：取100 mg粉末樣品，加入2 ml緩沖液A（pH=1.0）；另取100 mg粉末樣品，加入2 ml緩沖液B（pH=4.5）。將兩份混合物置離心機中，4℃下以12 000 r/min離心15 min。分別取兩份樣品中的上清，稀釋10倍后直接在510 nm分光光度計下檢測吸光值。

2.3 花青苷組分分析

2.3.1 液相條件 色譜柱：ACQUITY BEH C18（1.7μm，2.1 mm×100 mm）；流動相：A相為超純水（加入0.1%甲酸），B相為甲醇（加入0.1%甲酸）；洗脫梯度：B相比例0 min為5%，6 min增至50%，12 min增至95%，保持2 min；14min降至5%，并平衡2min；流速：0.35ml/min；柱溫：40℃；進樣量：2μl。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（Electrospray Ioniza?tion，ESI）溫度550°C，正離子模式下質(zhì)譜電壓5 500 V，氣簾氣（curtain gas，CUR）35 psi。

2.3.3 花青苷組分定性分析 采用Analyst 1.6.3軟件處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)，參考標準品的保留時間與峰型信息，對待測物在不同樣本中檢測到的質(zhì)譜峰進行積分校正，以確保定性的準確?；诨ㄇ嘬諛藴势窐?gòu)建MWDB數(shù)據(jù)庫（武漢邁維代謝生物科技公司）對質(zhì)譜檢測的數(shù)據(jù)進行定性分析。對所有樣本進行定性分析，每個色譜峰的峰面積（Area）代表對應(yīng)物質(zhì)的相對含量，代入線性方程和計算公式，最終得到所有樣本中待測物的定性分析結(jié)果。

2.3.4 花青苷組分定量分析 利用三重四級桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM）分析完成。配制0.01 ng/ml、0.05 ng/ml、0.1 ng/ml、0.5 ng/ml、1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、500 ng/ml、1 000 ng/ml、2 000 ng/ml、5 000 ng/ml不同濃度的標準品溶液，獲取各個濃度標準品的對應(yīng)定量信號的質(zhì)譜峰強度數(shù)據(jù)；以標準品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制不同物質(zhì)的標準曲線。將檢測到的所有樣本的積分峰面積代入標準曲線線性方程進行計算，最終得到實際樣本中該物質(zhì)的絕對含量。計算公式如下：樣本中代謝物的含量（μg/g）=c×V/1 000 000/m，其中c表示樣本中積分峰面積代入標準曲線得到的濃度值（ng/ml），V表示復(fù)溶時所用溶液的體積（μl），m表示稱取的樣本質(zhì)量（g）。

2.4 數(shù)據(jù)分析 使用Microsoft Office Excel 2016和SPSS 23.0進行統(tǒng)計分析。使用單因素方差分析（ANOVA）和Duncan倍數(shù)進行統(tǒng)計學(xué)評估確定顯著差異，P＜0.05為有顯著性差異。使用Adobe Illustrator CS6繪制圖片，熱圖使用Tbtools繪制。

3 結(jié)果與分析

3.1 黑老虎果實發(fā)育過程果實顏色變化和花青苷總量定量分析 黑老虎成熟果實呈現(xiàn)出紫紅色。本研究選取了黑老虎果實發(fā)育過程中三個具有代表性的時期進行花青苷組分和含量的分析。如圖1所示，黑老虎果實發(fā)育的幼果期（S1）果實顏色為綠色，對應(yīng)花后120 d；轉(zhuǎn)色期（S2）果實開始有少量變紅，對應(yīng)花后160 d；著色期（S3）果實已經(jīng)完全變成了紫紅色，對應(yīng)花后200 d。通過紫外分光光度計法測定黑老虎三個不同發(fā)育時期果實中的總花青苷含量，結(jié)果顯示：S1時期黑老虎果實中未檢出花青苷，S2和S3時期果實中的花青苷總含量分別為（6.35±0.83）μg/g和（152.45±18.62）μg/g（圖2）。從黑老虎果實發(fā)育過程中花青苷總含量的變化，結(jié)合圖1中黑老虎不同發(fā)育時期果實的色澤外觀的變化情況，筆者推測花青苷總含量的變化是黑老虎果實發(fā)育過程中顏色變化的主要影響因素。

圖1 黑老虎三個果實發(fā)育時期顏色變化

圖2 黑老虎三個果實發(fā)育時期中花青苷總含量

3.2 黑老虎果實發(fā)育過程花青苷各組分鑒定 本研究基于武漢邁維代謝生物科技有限公司開發(fā)的基于花青苷標準品構(gòu)建的MWDB數(shù)據(jù)庫進行靶向代謝組分析，用于鑒定花青苷組分的MWDB數(shù)據(jù)庫中包含36種花青苷組分。在黑老虎S3時期的果實中，總共檢測并鑒定出17種花青苷組分，其中包括2種矮牽?；ㄉ?、3種飛燕草素、1種錦葵色素、4種芍藥花色素、5種矢車菊素和2種天竺葵色素的糖苷衍生物。見表1。

表1 17種花青苷化合物信息表

3.3 黑老虎果實發(fā)育過程花青苷各組分含量分析

3.3.1 標準曲線的制作 對黑老虎S3時期果實中鑒定到的17種花青苷組分，分別將對應(yīng)的標準品按照方法2、3、4中的描述配置不同濃度的標準品溶液，獲取各個濃度標準品的對應(yīng)定量信號的質(zhì)譜峰強度數(shù)據(jù)；以標準品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制不同物質(zhì)的標準曲線，見表2。由表2可見，本研究所檢測物質(zhì)的標準曲線線性方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.99，表明構(gòu)建的標準曲線方程可靠，可用于下一步黑老虎果實花青苷的定量分析。

表2 17種花青苷組分的線性關(guān)系

3.3.2 花青苷組分含量分析 通過三重四級桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式，檢測黑老虎果實S1～S3三個果實發(fā)育時期果實中不同類型花青苷組分對應(yīng)的積分峰面積，將檢測到的所有樣本的積分峰面積代入標準曲線線性方程進行計算，最終得到花青苷各組分的含量。黑老虎發(fā)育時期果實中17種花青苷含量如表3所示。

表3 黑老虎三個果實發(fā)育時期果實中17種花青苷組分含量

表3結(jié)果顯示：在S3時期，果實中矢車菊素3-O-蕓香糖苷占總花青苷含量的51.96%，矢車菊素3-O-葡萄糖苷占總花青苷含量的29.31%，飛燕草素3-O-葡萄糖苷占總花青苷含量的10.37%，這3種花青苷組分占檢測到的17種花青苷組分總含量的91.64%，其余各花青苷組分占總花青苷含量的8.36%。因此，矢車菊素3-O-蕓香糖苷、矢車菊素3-O-葡萄糖苷和飛燕草素3-O-葡萄糖苷是導(dǎo)致黑老虎果實紫紅色外觀變化的主要花青苷組分。

3.3.3 花青苷組分含量的熱圖顯示 為了更好地展示和分析黑老虎果實發(fā)育過程中花青苷各組分含量的變化與果實色澤之間的關(guān)系，筆者采用熱圖來進行展示（圖3）。在黑老虎果實S1時期，果實中17種花青苷組分的含量均為0μg/g（未檢出）。在S2時期果實中，檢測到了7種花青苷組分的含量有所增加，分別為矢車菊素3-O-蕓香糖苷（3.17μg/g），矢車菊素3-O-葡萄糖苷（1.42μg/g）、飛燕草素3-O-葡萄糖苷（0.64μg/g）、芍藥花色素3-O-蕓香糖苷（0.13μg/g）、飛燕草素3-O-蕓香糖苷（0.05μg/g）、錦葵色素3-O-葡萄糖苷（0.03μg/g）和芍藥花色素3，5-O-二葡萄糖苷（0.02μg/g），但各組分的含量均較低。黑老虎果實發(fā)育S3時期果實中，7種在S2時期檢測到的花青苷組分均明顯增加，此外，在S3時期果實中還檢測到了另外的10種花青苷組分，其中含量大于0.10μg/g的有4種，含量低于0.10μg/g有6種。

圖3 黑老虎三個果實發(fā)育時期中花青苷組分熱圖

4 討 論

本研究以黑老虎果實發(fā)育過程中色澤特征變化上最具代表性的三個不同時期作為切入點，運用UPLC-MS/MS技術(shù)建立了檢測黑老虎果實中花青苷各組分和含量的靶向代謝組學(xué)方法，鑒定出黑老虎S3時期果實中的17種花青苷組分，并對三個不同時期黑老虎果實中各組分的含量進行了定量分析。確定了矢車菊素3-O-蕓香糖苷、矢車菊素3-O-葡萄糖苷和飛燕草素3-O-葡萄糖苷是形成黑老虎果實紫紅色外觀最主要的3種成分，分別占總花青苷組分的51.96%、29.31%和10.37%。

花青苷是植物果實中的主要色素之一，同時也是果實成熟的標志。在許多植物的果實中，通?？梢澡b定到6種不同的花青苷：矢車菊素、飛燕草素、芍藥花色素、天竺葵色素、矮牽牛色素和錦葵色素。有研究表明，矢車菊素是存在果實中最普遍的花青苷類型［26］。飛燕草素、矮牽牛色素和錦葵色素通常在植物中顯現(xiàn)出深藍色或是紫色，而矢車菊素和天竺葵色素是鮮紅色水果和花卉中的主要花青苷類型［27］。因此在本研究中，矢車菊素3-O-蕓香糖苷、矢車菊素3-O-葡萄糖苷和飛燕草素3-O-葡萄糖苷作為主要的花青苷組分綜合在一起形成了紫紅色的黑老虎果實色澤外觀，這與研究是相符的。

本研究鑒定了黑老虎紫紅色果實色澤外觀的主要花青苷組分，對于后續(xù)研究黑老虎果實發(fā)育過程中花青苷的變化提供了代謝物質(zhì)基礎(chǔ)，同時也為黑老虎的進一步開發(fā)利用提供了參考。