醉茄素A通過circOSBPL10/miR-128-3p通路調(diào)控乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞糖酵解、增殖、遷移及侵襲的機(jī)制研究

樊倩，楊程，劉云霓

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中心醫(yī)院甲乳外科，武漢 430000）

乳腺癌是威脅女性生命安全的惡性腫瘤之一，中國(guó)乳腺癌發(fā)病率與病死率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，既往研究證實(shí)，植物提取物具有抗腫瘤的作用，西黃丸、小檗堿等可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡進(jìn)而發(fā)揮抗乳腺癌的作用[1-3]。醉茄素A是茄科植物醉茄中提取的主要活性成分，具有抗炎、抗腫瘤的作用，并可抑制膽囊癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4]。環(huán)狀RNA（circRNA）是3’端與5’端以共價(jià)鍵結(jié)合形成的RNA分子，其具有組織特異性與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性等特點(diǎn)，研究表明circOSBPL10在胃癌組織中上調(diào)表達(dá)，沉默其表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[5]。靶基因預(yù)測(cè)顯示circOSBPL10與miR-128-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，miR-128-3p通過靶向LIMK1抑制乳腺癌發(fā)展進(jìn)程[6]。但醉茄素A是否通過circOSBPL10/miR-128-3p通路調(diào)控乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞糖酵解、增殖、遷移和侵襲目前還尚未可知。因此，本研究主要探討醉茄素A對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞糖酵解、增殖、遷移、侵襲的影響及其對(duì)circOSBPL10/miR-128-3p通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 醉茄素A購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；miR-128-3p寡核苷酸模擬物（miR-128-3p mimics）及陰性對(duì)照mimic NC序列（miR-NC）、circOSBPL10小分子干擾RNA（si-circOSBPL10）及陰性對(duì)照序列（si-NC）購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；pcDNA與circOSBPL10過表達(dá)載體pcDNA-circOSBPL10購(gòu)自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑、SYBR Green試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；噻唑藍(lán)（MTT）試劑、Matrigel基質(zhì)膠、葡萄糖、丙酮酸激酶與乳酸含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；己糖激酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海信帆生物；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；熒光素酶活性檢測(cè)試劑及其系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Promega公司；兔抗人蛋白細(xì)胞增殖核抗原-67（Ki-67）、基質(zhì)金屬白酶-2（MMP-2）、基質(zhì)金屬白酶-9（MMP-9）抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Multiskan Mk3酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；電泳儀購(gòu)自美國(guó)BioRad公司；StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRt-PCR）儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231細(xì)胞（1×105個(gè)/mL）接種于 96 孔板（100 μL/孔），分別加入不同濃度（10、20、40 μg/mL）的醉茄素 A 預(yù)處理細(xì)胞24 h[7]，分別記為醉茄素A低劑量組、醉茄素A中劑量組、醉茄素A高劑量組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞轉(zhuǎn)染用不含血清的培養(yǎng)液稀釋si-NC、si-circOSBPL10后作為A液，用不含血清的培養(yǎng)液稀釋Lipofectamine2000后作為B液，A液與B液充分混勻后室溫孵育20min，將其加入MDAMB-231細(xì)胞中，分別記為si-NC組、si-circOSBPL10組?；貜?fù)實(shí)驗(yàn)：pcDNA、pcDNA-circOSBPL10分別轉(zhuǎn)染入MDA-MB-231細(xì)胞后加入40 μg/mL的醉茄素A處理細(xì)胞24 h，分別記為醉茄素A+pcDNA組、醉茄素A+pcDNA-circOSBPL10組。

1.2.3 檢測(cè)葡萄糖消耗、乳酸產(chǎn)生 收集“1.2.1”各分組MDA-MB-231細(xì)胞后經(jīng)3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心，棄上清液，加入1 mL蒸餾水后應(yīng)用超聲波破碎細(xì)胞，根據(jù)試劑盒說明書檢測(cè)葡萄糖消耗與乳酸產(chǎn)生量。

1.2.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集各組MDA-MB-231細(xì)胞（1×105個(gè)/mL）接種于 96孔板（100 μL/孔），每孔加入質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT溶液20 μL，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，將DMSO加入96孔板（150 μL/孔），室溫避光孵育 5 min后應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度值（OD 490 nm）并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率[（對(duì)照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD）/（對(duì)照組OD-空白組 OD）×100%]。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲 收集各組MDA-MB-231細(xì)胞加入0.25%胰蛋白酶消化后加入培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液（2.5×105個(gè)/mL），將其加入小室的上室（200 μL/孔），下室加入 600 μL 含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h后采用多聚甲醛溶液固定20 min，采用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后加入0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，應(yīng)用顯微鏡觀察遷移細(xì)胞數(shù)。采用預(yù)冷培養(yǎng)液稀釋Matrigel基質(zhì)膠后加入小室的上室（40 μL/孔），于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)5 h后加入各組MDA-MB-231細(xì)胞懸液，后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用顯微鏡觀察侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中 circOSBPL10、miR-128-3p的表達(dá)水平 采用Trizol法提取各組MDA-MB-231細(xì)胞總RNA后置于-80℃超低溫冰箱內(nèi)保存。RNA 2 μL，10×RT Buffer 2 μL，dNTP 0.4 μL，Multiscripe RT 1 μL，10×Random Primer 2 μL，RNase-Free ddH2O 補(bǔ)足體系至 20 μL；反應(yīng)條件：25 ℃ 10 min，37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，4 ℃保存。qRT-PCR反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10μL/孔，正反向引物 0.8μL/孔，cDNA1μL/孔，ddH2O補(bǔ)足體系至20 μL；反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min循環(huán)1次，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環(huán) 40 次。采用 2-ΔΔCt法計(jì)算 circOSBPL10、miR-128-3p相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)circOSBPL10與miR-128-3p的靶向關(guān)系 StarBase預(yù)測(cè)顯示circOSBPL10與miR-128-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，含有結(jié)合位點(diǎn)的片段克隆至pmirGLO載體得到野生型載體WT-circOSBPL10，采用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，含有突變位點(diǎn)的片段克隆至pmirGLO載體得到突變型載體 MUT-circOSBPL10，miR-NC、miR-128-3p mimics分別與 WT-circOSBPL10、MUT-circOSBPL10共轉(zhuǎn)染入MDA-MB-231細(xì)胞后置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性。

1.2.8 Western blot檢測(cè) Ki-67、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá) 各組MDA-MB-231細(xì)胞中加入500 μL RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度后加入上樣緩沖液，沸水孵育10 min，蛋白變性，取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜后室溫封閉2 h（5%脫脂奶粉），加入稀釋比例1∶1 000 的一抗與內(nèi)參 GAPDH（1∶1 000）一抗，將其置于4℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育過夜，采用TBST洗滌后加入二抗稀釋液（1∶50 000），將其置于室溫條件下孵育1 h，采用TBST洗滌，滴加ECL，暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值（蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參照條帶灰度值）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 醉茄素A對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞糖酵解的影響 與對(duì)照組比較，醉茄素A低劑量組、醉茄素A中劑量組、醉茄素A高劑量組葡萄糖消耗與乳酸生成量以及丙酮酸激酶、己糖激酶的水平均明顯降低（P＜0．05），且醉茄素 A 低劑量組、醉茄素 A中劑量組、醉茄素A高劑量組間各指標(biāo)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見表1。

表1 醉茄素A對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞糖酵解的影響（±s）Tab.1 Effect of withaferin A on glycolysis of breast cancer MDA-MB-231 cells（±s）

表1 醉茄素A對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞糖酵解的影響（±s）Tab.1 Effect of withaferin A on glycolysis of breast cancer MDA-MB-231 cells（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0．05；與醉茄素 A 低劑量組比較，#P＜0．05；與醉茄素 A 中劑量組比較，△P＜0．05。

組別對(duì)照組醉茄素A低劑量組醉茄素A中劑量組醉茄素A高劑量組n 9 9 9 9葡萄糖消耗（μmol/L） 乳酸生產(chǎn)量（μmol/L） 丙酮酸激酶（U/mg） 己糖激酶（U/mg）33．61±3．04 46．43±3．68 0．96±0．07 8．65±0．76 25．21±2．14* 36．06±2．56* 0．75±0．06* 6．52±0．51*16．85±1．23*# 22．53±2．11*# 0．61±0．05*# 5．02±0．49*#10．01±1．03*#△ 13．81±1．26*#△ 0．44±0．04*#△ 3．54±0．41*#△

2.2 醉茄素A對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組比較，醉茄素A低劑量組、醉茄素A中劑量組、醉茄素A高劑量組細(xì)胞增殖抑制率升高（P＜0．05），Ki-67 蛋白水平降低（P＜0．05），且醉茄素A低劑量組、醉茄素A中劑量組、醉茄素A高劑量組間細(xì)胞增殖抑制率、Ki-67蛋白水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見圖1、表2。

圖1 Ki-67蛋白表達(dá)Fig.1 Expression of Ki-67 protein

表2 醉茄素A對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響（±s）Tab.2 Effect of withaferin A on the proliferation of breast cancer MDA-MB-231 cells（±s）

表2 醉茄素A對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響（±s）Tab.2 Effect of withaferin A on the proliferation of breast cancer MDA-MB-231 cells（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0．05；與醉茄素A低劑量組比較，#P＜0．05；與醉茄素 A 中劑量組比較，△P＜0．05。

組別 n 抑制率（%） K i-6 7蛋白對(duì)照組 9 0．0 0±0．0 0 0．6 5±0．0 4醉茄素 A 低劑量組 9 2 6．5 8±2．0 8* 0．5 1±0．0 3*醉茄素 A 中劑量組 9 4 0．5 6±3．4 8*# 0．3 9±0．0 3*#醉茄素 A 高劑量組 9 6 5．7 7±4．5 7*#△ 0．2 3±0．0 2*#△

2.3 醉茄素A對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移、侵襲的影響 與對(duì)照組比較，醉茄素A低劑量組、醉茄素A中劑量組、醉茄素A高劑量組遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)減少（P＜0．05），MMP-2、MMP-9 蛋白水平降低（P＜0．05），且醉茄素 A 低劑量組、醉茄素 A 中劑量組、醉茄素A高劑量組間上述指標(biāo)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見圖2、表3。

圖2 醉茄素A對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移、侵襲的影響Fig.2 Effect of withaferin A on the migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells

表3 醉茄素A對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移侵襲的影響（±s）Tab.3 Effect of withaferin A on the migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells（±s）

表3 醉茄素A對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移侵襲的影響（±s）Tab.3 Effect of withaferin A on the migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0．05；與醉茄素 A 低劑量組比較，#P＜0．05；與醉茄素 A 中劑量組比較，△P＜0．05。

組別 n 遷移細(xì)胞數(shù)（個(gè)） 侵襲細(xì)胞數(shù)（個(gè)） MMP-2蛋白 MMP-9蛋白對(duì)照組 6 117．71±11．69 98．51±7．79 0．84±0．06 0．58±0．03醉茄素 A 低劑量組 6 87．71±5．43* 79．07±5．43* 0．71±0．04* 0．44±0．03*醉茄素 A 中劑量組 6 69．75±5．25*# 57．71±3．54*# 0．56±0．04*# 0．29±0．02*#醉茄素 A 高劑量組 6 48．94±4．75*#△ 37．04±3．04*#△ 0．39±0．03*#△ 0．16±0．02*#△

2.4 醉茄素A對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞circOSBPL10和miR-128-3p表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，醉茄素A低劑量組、醉茄素A中劑量組、醉茄素A高劑量組 circOSBPL10 的表達(dá)水平降低（P＜0．05），miR-128-3p的表達(dá)水平升高（P＜0．05），且醉茄素 A 低劑量組、醉茄素A中劑量組、醉茄素A高劑量組間circOSBPL10、miR-128-3p的表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見表4。

表4 醉茄素A對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞circOSBPL10和miR-128-3p表達(dá)的影響（±s）Tab.4 Effect of withaferin A on the expression of circOSBPL10 and miR-128-3p in breast cancer MDAMB-231 cells（±s）

表4 醉茄素A對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞circOSBPL10和miR-128-3p表達(dá)的影響（±s）Tab.4 Effect of withaferin A on the expression of circOSBPL10 and miR-128-3p in breast cancer MDAMB-231 cells（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0．05；與醉茄素A低劑量組比較，#P＜0．05；與醉茄素 A 中劑量組比較，△P＜0．05。

組別 n circOSBPL10 miR-128-3p對(duì)照組 9 1．00±0．06 1．00±0．05醉茄素 A 低劑量組 9 0．79±0．05* 1．68±0．15*醉茄素 A 中劑量組 9 0．62±0．04*# 2．53±0．21*#醉茄素 A 高劑量組 9 0．47±0．03*#△ 3．10±0．21*#△

2.5 circOSBPL10靶向?qū)iR-128-3p表達(dá)的影響 StarBase預(yù)測(cè)顯示circOSBPL10與miR-128-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖3。miR-128-3p過表達(dá)可明顯降低野生型載體WT-circOSBPL10的熒光素酶活性（P＜0．05），而對(duì)突變型載體 MUT-circOSBPL10 的熒光素酶活性無明顯影響（P＞0．05），見表5。與pcDNA組比較，pcDNA-circOSBPL10組miR-128-3p的表達(dá)水平降低（P＜0．05）；與 si-NC 組比較，si-circOSBPL10組miR-128-3p的表達(dá)水平升高（P＜0．05），見表6。

圖3 circOSBPL10的序列中含有與miR-128-3p互補(bǔ)的核苷酸序列Fig.3 Sequence of circOSBPL10 contains a nucleotide sequence complementary to miR-128-3p

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（±s）Tab.5Double luciferase report experiment（±s）

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（±s）Tab.5Double luciferase report experiment（±s）

注：與 miR-NC 組比較，*P＜0．05。

組別 n WT-circOSBPL10 MUT-circOSBPL10 miR-NC 組 9 1．02±0．06 1．04±0．07 miR-128-3p 組 9 0．53±0．04* 1．01±0．06

表6 circOSBPL10調(diào)控 miR-128-3p的表達(dá)（±s）Tab.6 Expression of miR-128-3p regulated by the circOSBPL10（±s）

表6 circOSBPL10調(diào)控 miR-128-3p的表達(dá)（±s）Tab.6 Expression of miR-128-3p regulated by the circOSBPL10（±s）

注：與 pcDNA 組比較，*P＜0．05；與 si-NC 組比較，#P＜0．05。

組別 n miR-128-3p pcDNA 組 9 1．00±0．06 pcDNA-circOSBPL10 組 9 0．41±0．03*si-NC 組 9 0．98±0．06 si-circOSBPL10 9 2．76±0．22#

2.6 抑制circOSBPL10表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞糖酵解、增殖、遷移、侵襲的影響 與si-NC組比較，si-circOSBPL10組葡萄糖消耗與乳酸產(chǎn)生量以及丙酮酸激酶、己糖激酶的水平均明顯降低（P＜0．05），細(xì)胞增殖抑制率升高（P＜0．05），遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)減少（P＜0．05），Ki-67、MMP-2、MMP-9 蛋白水平降低（P＜0．05），見圖4、圖5、表7、表8。

圖4 抑制circOSBPL10表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移、侵襲的影響Fig.4 Effect of inhibiting the expression of circOSBPL10 on the migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells

圖5 增殖、遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.5 Expression of the proliferation，migration and invasion related protein

表7 抑制circOSBPL10表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞糖酵解、增殖、遷移、侵襲的影響（±s）Tab.7 Effect of inhibiting circOSBPL10 expression on glycolysis，proliferation，migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells（±s）

表7 抑制circOSBPL10表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞糖酵解、增殖、遷移、侵襲的影響（±s）Tab.7 Effect of inhibiting circOSBPL10 expression on glycolysis，proliferation，migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells（±s）

注：與 si-NC 組比較，*P＜0．05。

組別si-NC組si-circOSBPL10組n 9 9 circOSBPL10 miR-128-3p葡萄糖消耗（μmol/L）侵襲細(xì)胞數(shù)（個(gè)）1．00±0．05 1．00±0．06 34．63±3．16 48．34±3．52 0．99±0．08 8．87±0．79 6．04±0．51 116．92±11．08 95．72±5．34 0．31±0．03* 2．85±0．21* 13．76±1．28*19．81±1．61* 0．52±0．05* 4．45±0．47* 52．61±4．66* 56．08± 4．62*43．17±4．02*乳酸生成量（μmol/L）丙酮酸激酶（U/mg）己糖激酶（U/mg）抑制率（%）遷移細(xì)胞數(shù)（個(gè)）

表8 抑制circOSBPL10表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s）Tab.8 Effect of inhibiting the expression of circOSBPL10 on the expression of proliferation，migration and invasionrelated proteins in breast cancer MDA-MB-231 cells（±s）

表8 抑制circOSBPL10表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s）Tab.8 Effect of inhibiting the expression of circOSBPL10 on the expression of proliferation，migration and invasionrelated proteins in breast cancer MDA-MB-231 cells（±s）

注：與 si-NC 組比較，*P＜0．05。

組別 n Ki-67蛋白 MMP-2蛋白 MMP-9蛋白si-NC 組 9 0．66±0．05 0．86±0．06 0．56±0．04 si-circOSBPL10 組 9 0．29±0．02* 0．44±0．03* 0．24±0．02*

2.7 circOSBPL10過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了醉茄素A（40μg/mL）對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞糖酵解、增殖、遷移和侵襲的作用 與醉茄素A+pcDNA組比較，醉茄素A+pcDNA-circOSBPL10組葡萄糖消耗與乳酸產(chǎn)生量以及丙酮酸激酶、己糖激酶的水平均明顯升高（P＜0．05），細(xì)胞增殖抑制率降低（P＜0．05），遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)增多（P＜0．05），Ki-67、MMP-2、MMP-9 蛋白水平升高（P＜0．05），見圖6、圖7、表9、表10。

圖6 乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲Fig.6 Migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells

圖7 增殖、遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.7 Expression of the proliferation，migration and invasion related protein

表9 circOSBPL10過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了醉茄素A對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞糖酵解、增殖、遷移和侵襲的作用（±s）Tab.9 Overexpression of circOSBPL10 reversed the effects of withaferin A on glycolysis，proliferation，migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells（±s）

表9 circOSBPL10過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了醉茄素A對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞糖酵解、增殖、遷移和侵襲的作用（±s）Tab.9 Overexpression of circOSBPL10 reversed the effects of withaferin A on glycolysis，proliferation，migration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells（±s）

注：與醉茄素 A+pcDNA 組比較，*P＜0．05。

組別醉茄素A+pcDNA組醉茄素A+pcDNA-circOSBPL10組n 9 9 circOSBPL10 miR-128-3p 葡萄糖消耗（μmol/L）侵襲細(xì)胞數(shù)（個(gè)）1．00±0．06 1．00±0．04 10．17±0．99 12．58±1．14 0．39±0．04 3．12±0．29 67．17±4．61 46．61±4．08 36．09±3．23乳酸生成量（μmol/L）丙酮酸激酶（U/mg）己糖激酶（U/mg）抑制率（%）遷移細(xì)胞數(shù)（個(gè)）2．73±0．21* 0．41±0．03* 24．21±2．18*34．98±3．12* 0．82±0．07* 7．13±0．77* 22．52±2．09* 91．63±6．58* 80．57±6．09*

表10 circOSBPL10過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了醉茄素A對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的作用（±s）Tab.10 Overexpression of circOSBPL10 reversed the effect of withaferin A on the proliferation，migration and invasion-related protein expression of breast cancer MDAMB-231 cells（±s）

表10 circOSBPL10過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了醉茄素A對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的作用（±s）Tab.10 Overexpression of circOSBPL10 reversed the effect of withaferin A on the proliferation，migration and invasion-related protein expression of breast cancer MDAMB-231 cells（±s）

注：與醉茄素 A+pcDNA 組比較，*P＜0．05。

組別 n Ki-67蛋白 MMP-2蛋白 MMP-9蛋白醉茄素 A+pcDNA 組 9 0．22±0．02 0．38±0．03 0．15±0．02醉茄素A+pcDNA-circOSBPL10組9 0．57±0．03* 0．75±0．04* 0．47±0．03*

3 討論

乳腺癌的治療方案主要包括手術(shù)、放療、化療等，降低患者生活質(zhì)量。隨著研究的不斷深入，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，植物提取物及其活性成分對(duì)抗乳腺癌具有抑制作用，例如，葛根素通過阻斷核因子-κB（NF-κB）和外周信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（Erk）途徑抑制乳腺癌細(xì)胞遷移，侵襲和黏附[8]。人參皂苷Rh2通過調(diào)控LncRNA C3orf67-AS1抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖[9]。番石榴堿通過阻斷STAT3信號(hào)通路而抑制乳腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[10]。但醉茄素A治療乳腺癌的分子機(jī)制尚未闡明。

醉茄素A對(duì)乳腺癌等腫瘤細(xì)胞具有明顯抑制作用，研究表明醉茄素A可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與抑制PI3K/Akt通路的激活有關(guān)[11]。醉茄素A可促進(jìn)肝癌耐藥細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與抑制JAK/STAT通路的活化有關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，不同劑量的醉茄素A可明顯降低乳腺癌細(xì)胞葡萄糖消耗與乳酸生成量，且隨著藥物濃度的增加而明顯降低。葡萄糖消耗與乳酸生成量以及丙酮酸激酶、己糖激酶的水平是反應(yīng)糖酵解水平的重要指標(biāo)，而糖酵解水平升高可促進(jìn)細(xì)胞增殖[13]。本研究結(jié)果提示醉茄素A可降低乳腺癌細(xì)胞糖酵解水平，且呈劑量依賴性。本研究結(jié)果顯示，不同劑量的醉茄素A處理后可明顯提高乳腺癌細(xì)胞增殖抑制率，并可抑制Ki-67的表達(dá)，且呈劑量依賴性。研究表明Ki-67的表達(dá)情況可作為判斷腫瘤細(xì)胞增殖活性的指標(biāo)，其表達(dá)量升高預(yù)示增殖能力增強(qiáng)[14]。提示醉茄素A可能通過降低乳腺癌細(xì)胞糖酵解水平而抑制細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示，不同劑量的醉茄素A作用于乳腺癌細(xì)胞后可明顯減少遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)，還可抑制MMP-2、MMP-9的表達(dá)，且呈劑量依賴性。MMP-2、MMP-9蛋白是反映細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的檢測(cè)指標(biāo)，其發(fā)揮作用與降解細(xì)胞外基質(zhì)沉積有關(guān)[15]。提示醉茄素A可抑制乳腺癌細(xì)胞遷移及侵襲。然而，醉茄素A調(diào)控乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制尚未可知。

為進(jìn)一步探討醉茄素A影響乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制，本研究采用qRT-PCR檢測(cè)醉茄素A處理后乳腺癌細(xì)胞中基因表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)circOSBPL10的表達(dá)水平降低，且隨著藥物劑量的增加而明顯降低，提示醉茄素A可能通過抑制circOSBPL10的表達(dá)從而發(fā)揮抗乳腺癌的作用。circOSBPL10在宮頸癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，并可通過miR-1179/UBE2Q1軸增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移能力[16]。本研究結(jié)果顯示，抑制circOSBPL10表達(dá)可明顯降低乳腺癌細(xì)胞葡萄糖消耗與乳酸生成量，提高細(xì)胞增殖抑制率，而減少遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)，提示抑制circOSBPL10表達(dá)可降低乳腺癌細(xì)胞糖酵解水平而抑制細(xì)胞增殖，并可降低細(xì)胞遷移及侵襲能力。本研究進(jìn)一步證實(shí)circOSBPL10可充當(dāng)miR-128-3p的海綿分子，并可負(fù)向調(diào)控miR-128-3p的表達(dá)。miR-128-3p通過靶向ZEB1而抑制食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[17]。LncRNA PVT1通過調(diào)節(jié)miR-128-3p/GREM1軸促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展[18]。抑制LncRNA MIR4435-2HG通過調(diào)節(jié)miR-128-3p/MSI2軸而抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[19]。LncRNA TUG1通過調(diào)節(jié)miR-128-3p/YES1軸而加速前列腺癌的進(jìn)展[20]。本研究結(jié)果顯示，醉茄素A處理的乳腺癌細(xì)胞中miR-128-3p的表達(dá)水平升高，且隨著藥物濃度的增加而明顯升高，提示醉茄素A可能通過降低circOSBPL10的表達(dá)而上調(diào)miR-128-3p的表達(dá)，分析原因可能為circOSBPL10序列上含有miR-128-3p的結(jié)合位點(diǎn)，circOSBPL10可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-128-3p而負(fù)向調(diào)控其表達(dá)。同時(shí)，采用醉茄素A與circOSBPL10過表達(dá)聯(lián)合處理乳腺癌細(xì)胞，結(jié)果顯示，葡萄糖消耗與乳酸生成量均明顯升高，而細(xì)胞增殖抑制率降低，細(xì)胞遷移及侵襲能力增強(qiáng)，提示醉茄素A可通過下調(diào)circOSBPL10的表達(dá)而上調(diào)miR-128-3p的表達(dá)從而調(diào)控乳腺癌細(xì)胞糖酵解、增殖、遷移及侵襲。

綜上所述，醉茄素A可通過調(diào)控circOSBPL10/miR-128-3p軸而降低乳腺癌細(xì)胞糖酵解水平進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，并可抑制乳腺癌細(xì)胞遷移及侵襲，circOSBPL10/miR-128-3p軸可能作為醉茄素A治療乳腺癌的潛在靶點(diǎn)。但醉茄素A如何調(diào)控circOSBPL10/miR-128-3p通路下游靶基因，及其可能作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探究，下一步實(shí)驗(yàn)將采用體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證circOSBPL10/miR-128-3p通路在醉茄素A抗乳腺癌中的作用機(jī)制。