原代人口腔角質(zhì)細(xì)胞在產(chǎn)黑普氏菌作用后的轉(zhuǎn)錄組分析

口腔扁平苔蘚（oral lichen planus，OLP）是口腔黏膜病?？浦凶畛Ｒ姷募膊≈?，最新研究表明整體發(fā)病率在0.89%左右

。目前OLP 發(fā)病機(jī)制尚不明確，普遍認(rèn)為OLP 是機(jī)體內(nèi)在與外在因素聯(lián)合作用引發(fā)的疾病。在一些外在因素（病原體、藥物、牙科材料等）作用下，易感人群口腔黏膜病損部位的上皮細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞活化，這些細(xì)胞分泌多種炎癥因子與趨化因子，激活T 淋巴細(xì)胞，形成持續(xù)存在的免疫炎癥反應(yīng)

。在OLP 患者的唾液、組織及頰黏膜拭子中發(fā)現(xiàn)了菌群失調(diào)的現(xiàn)象

，菌群失調(diào)可能在OLP 發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用

。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，OLP 組頰黏膜表面微生物菌落結(jié)構(gòu)與健康對照組相比發(fā)生顯著性改變，其中產(chǎn)黑普氏菌（

，

.

）在OLP 組頰黏膜表面構(gòu)成比顯著增加，且該菌能夠侵入到OLP 病損組織上皮層及固有層，并與巨噬細(xì)胞相互作用，提示

.

可能在OLP 的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用

。而口腔黏膜上皮角質(zhì)形成細(xì)胞作為抵抗外界入侵的第一道屏障，

.

與口腔上皮角質(zhì)細(xì)胞的相互作用并不清楚。

轉(zhuǎn)錄組測序是對特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA 的總和進(jìn)行高通量測序。通過新一代高通量測序，能夠全面快速地獲得某一物種特定組織或器官在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本序列信息。目前，對OLP 轉(zhuǎn)錄組研究并不完善，多集中于OLP 的癌變傾向

、OLP 的炎癥反應(yīng)過程

等。有關(guān)口腔共生菌作用下，口腔上皮角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的改變目前尚無研究。因此本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，研究原代人口腔角質(zhì)形成細(xì)胞（primary human oral keratinocytes，pHOKs）在

.

刺激下基因表達(dá)的改變，對差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并篩選其中的差異基因進(jìn)行驗(yàn)證，為探究DEGs 所參與的通路與OLP 的相關(guān)性提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

分別計(jì)算(xp1,yp1)、(xp2,yp2) 、(xp3,yp3)、(xp4,yp4)的距離差值d,取d(i)的最小值對應(yīng)的坐標(biāo)作為改進(jìn)灰狼算法的初始值,i的取值為1～4。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

人口腔角質(zhì)形成細(xì)胞系（human oral keratino?cyte，HOK）由陳謙明教授惠贈(zèng)

。

ATCC

25845

（ATCC，美國），OKM 培養(yǎng)基（Sciencell，美國），PBS（上海生工，中國），dispase酶（Sigma，美國），DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone，美國），胎牛血清（WISENT，美國），RNAiso Plus（TaKaRa，中國），無水乙醇（上海生工，中國），氯仿（國藥，中國），異丙醇（國藥，中國），PrimeScript

RT reagent?Kit Perfect Real Time（TaKaRa，中國），TB Green Pre?mix Ex Taq（TaKaRa，中國），BCA protein assay kit（Solarbio，中國），MYO1B 一抗（Santa Cruz，美國），β?Tubulin 一抗（Proteintech Biotechnology，中國），辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG（碧云天，中國），超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（碧云天，中國），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Thermo Fisher，美國），小型高速離心機(jī)（Eppendorf，美國），Bio?Rad 電泳系統(tǒng)（Bio?Rad，美國），多功能酶標(biāo)儀（Bio?Tek，美國）。

1.2 樣本的收集與處理

1.2.1 pHOKs 的分離與培養(yǎng) 本實(shí)驗(yàn)獲得同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（倫理審批號：2018?002）。組織來源于同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科智齒拔除術(shù)時(shí)取下的頰黏膜組織，把組織放到含10%雙抗PBS 中清洗三遍。隨后將組織放到0.25%中性蛋白酶（dispaseⅡ）中4 ℃過夜。第二天用無菌眼科鑷分離組織上皮，PBS 清洗2 次，0.25%含EDTA 的胰酶37 ℃震蕩消化4 min，用含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基終止消化，離心，去上清，PBS 清洗沉淀2 次，用2 mL OKM 培養(yǎng)基重懸沉淀并鋪板于六孔板，培養(yǎng)于37 ℃、5%體積分?jǐn)?shù)CO

的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

你說天底下竟有這么好玩的東西，無須自個(gè)兒露面（王爺小時(shí)候雖淘氣，人前卻是那樣的羞澀），只幕后把那些個(gè)花花綠綠的木偶肘在手上，張飛李逵關(guān)云長，想怎樣就怎樣，稀里嘩啦猛打一氣，實(shí)在是太合小時(shí)候王爺那顆心了，恨不能直接跟著那戲班子就上臺去。

1.2.2 HOK 細(xì)胞培養(yǎng) HOK 細(xì)胞以5×10

個(gè)/mL 的細(xì)胞密度接種于12 孔板中，在添加了10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中，37 ℃、5%體積分?jǐn)?shù)CO

的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待鏡下細(xì)胞密度達(dá)90%時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3

.

菌株培養(yǎng)與菌液制備 凍存于-80 ℃的

.

菌液于37 ℃化凍，均勻涂于基礎(chǔ)厭氧血平板，加厭氧袋置于密封袋，置于37 ℃孵箱復(fù)蘇；3 d 后挑取平板上黑褐色菌點(diǎn)于新鮮液體厭氧培養(yǎng)基中，蓋上并旋松管蓋，加厭氧袋置于密封袋中，置于37 ℃搖床。1 d 后測菌液OD

=1，以4 000 rpm離心3 min，棄上清，PBS 清洗3 次后，加1 mL PBS重懸菌液，最終菌液濃度為1×10

CFU/mL。

②菌液與HOK 細(xì)胞系共同培養(yǎng)：HOK 細(xì)胞吸去細(xì)胞上清液，PBS 輕柔洗滌細(xì)胞3 次，更換為不含F(xiàn)BS 的DMEM 培養(yǎng)基。

1.2.4 菌液與細(xì)胞共同培養(yǎng) ①菌液與pHOKs 共同培養(yǎng)：pHOKs 培養(yǎng)到第三代后用于實(shí)驗(yàn)，吸去細(xì)胞上清液，PBS 輕柔洗滌細(xì)胞3 次，更換為不含血清的DMEM 培養(yǎng)基，每孔加入10 μL 菌液，分別共培養(yǎng)4 h 和24 h 作為兩實(shí)驗(yàn)組，以未與菌液共培養(yǎng)的pHOKs 作為對照組，處理后的細(xì)胞于37 ℃、5%體積分?jǐn)?shù)CO

的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)長，隨后提取細(xì)胞總RNA 用于轉(zhuǎn)錄組測序。

③對照組與共培養(yǎng)24 h 組之間得到的上調(diào)DEGs 富集于12 條KEGG 通路中，顯示其與白介素?17（interleukin?17，IL?17）信號通路、TNF 信號通路、金黃色葡萄球菌感染（

infec?tion）等相關(guān)（圖4b）。

1.3 CCK?8 法檢測細(xì)胞活性

通過CCK?8 法檢測

.

刺激后HOK 細(xì)胞的活性。HOK 細(xì)胞與

.

共培養(yǎng)。共培養(yǎng)完成后，輕柔吸去細(xì)胞上清液，PBS 輕柔洗滌細(xì)胞3 次，每孔加入100 μL DMEM 培養(yǎng)基和10 μL CCK?8 溶液，避光反應(yīng)1 h。隨后在酶標(biāo)儀450 nm 處測定細(xì)胞上清液吸光度，相對細(xì)胞活力計(jì)算方法：（實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞吸光度/對照組細(xì)胞吸光度）×100%。

在清華,校長可以享有公車,但他寧愿步行；校長出差按規(guī)定可以乘坐飛機(jī),但他卻寧愿搭乘郵車,其目的無非是要為公家省些錢?？箲?zhàn)時(shí)期,清華、北大、南開三校合并成立“西南聯(lián)大”遷往內(nèi)地。云南省主席龍?jiān)频呐畠糊垏滔脒M(jìn)清華附中讀書,結(jié)果卻未能如愿。龍?jiān)菩睦锊凰?因?yàn)樗麑?zhàn)時(shí)的“西南聯(lián)大”多有資助。但后來當(dāng)他打聽到梅貽琦的女兒梅祖芬也未被錄取時(shí),他不但怨氣全消,還深懷敬意。有這樣的人去管理學(xué)校,還有什么不放心的呢。

1.4 總RNA 的提取

將樣本送至上海晶能生物科技有限公司完成轉(zhuǎn)錄組測序。基本程序?yàn)椋篟NA 片段化，逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，加工雙鏈DNA 末端，PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物熱變性形成單鏈，單鏈DNA 環(huán)化得到單鏈環(huán)狀DNA 文庫，DNA 文庫用Illumina Nova 6000 測序平臺進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測序，獲得高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。

1.5 轉(zhuǎn)錄組測序

將共培養(yǎng)完成后的細(xì)胞吸去上清，PBS 輕柔洗滌3 次，按試劑盒說明提取總RNA。測定RNA濃度。

1.6 測序結(jié)果的分析

對數(shù)據(jù)質(zhì)量評估，對所獲得的序列進(jìn)行基因注釋，用HTSeq 軟件計(jì)算各個(gè)基因的reads count。使用R 語言limma 包進(jìn)行DEGs 挑選。取log2（差異倍數(shù)）≥1 且

≤0.05 的基因篩選為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的DEGs。通過R 軟件的Pheatmap 包對DEGs 進(jìn)行聚類分析，用GO 數(shù)據(jù)庫對DEGs 進(jìn)行生物學(xué)功能注釋，用KEGG Pathway 數(shù)據(jù)庫對DEGs 進(jìn)行通路的注釋。利用R 語言富集常用包c(diǎn)lusterProfiler（版本3.18.0）對DEGs 做GO、KEGG pathway 的注釋富集分析。對DEGs 數(shù)量≥2，且統(tǒng)計(jì)

≤0.05 的注釋條目認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.7 qRT?PCR 驗(yàn)證差異表達(dá)基因

監(jiān)測數(shù)據(jù)還顯示，9月WTI原油均價(jià)為69.35美元/桶，環(huán)比上漲1.0%，同比漲幅42.6%；布倫特原油均價(jià)77.23美元/桶，環(huán)比上漲6.8%，同比漲幅41.9%；迪拜原油均價(jià)75.86美元/桶，環(huán)比上漲5.5%，同比漲幅45.5%；勝利原油均價(jià)67.96美元/桶，環(huán)比上漲5.0%，同比漲幅39.4%。上述四地原油9月平均價(jià)格為72.60美元/桶，環(huán)比上漲4.6%，同比漲幅42.4%。

1.8 Western Blot 驗(yàn)證差異表達(dá)基因

使用含1 mmol/L PMSF 的RIPA 裂解液提取HOK 細(xì)胞總蛋白，BCA 試劑盒測蛋白濃度。7.5%的SDS?PAGE 凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，封閉液室溫下封閉1 h，一抗孵育，4 ℃過夜，洗膜后加二抗，室溫孵育1 h，增強(qiáng)型化學(xué)法顯色，Im?ageQuant LAS 4000 mini 顯影。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPadPrism 8.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并繪制統(tǒng)計(jì)圖。多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析（one?way analysis of variance，ANOVA），以Tukey 進(jìn)行兩兩比較，

＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.4 疾病相關(guān)基因的高通量測序分析 將提取的患兒外周血全基因組DNA送至北京德易東方轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心進(jìn)行與腦發(fā)育異常相關(guān)的所有已知基因全外顯子及相應(yīng)剪切位點(diǎn)的高通量測序分析。

2 結(jié) 果

2.1 P.m 對HOK 細(xì)胞活力的影響

在倒置相差顯微鏡下可觀察到完整的HOK 單層細(xì)胞（圖1a），HOK 細(xì)胞與

.

共培養(yǎng)后，細(xì)胞密度降低，對培養(yǎng)皿底的黏附能力降低；部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，由原本大而扁平的多角形形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楸鈭A形或圓形，部分細(xì)胞的細(xì)胞核發(fā)生了核固縮，顯示出空泡變性和細(xì)胞裂解，細(xì)胞邊界不清晰（圖1b，10 μL 菌液與HOK 細(xì)胞共培養(yǎng)8 h 后鏡下圖）。

對共培養(yǎng)后HOK 細(xì)胞的細(xì)胞活力檢測結(jié)果（圖1c、1d）表明，

.

會(huì)降低HOK 細(xì)胞活力，在時(shí)間梯度組中，共培養(yǎng)4 h后細(xì)胞活力降低到68.38%±12.30%（

＜0.001），共培養(yǎng)6 h 后細(xì)胞活力降低至38.97% ± 1.05%（

＜0.001），共培養(yǎng)8 h 后細(xì)胞活力降低至27.44% ± 0.30%（

＜0.001）；在濃度梯度組 中10 μL 組 細(xì) 胞 活 力 下 降 至60.33% ± 3.93%（

＜0.001），20 μL 組細(xì)胞活力下降至44.9% ±2.77%（

＜0.001），30 μL 組 細(xì) 胞 活 力 下 降 至29.02%±2.46%（

＜0.001）。

②加強(qiáng)示范區(qū)建設(shè)。借鑒歐盟經(jīng)驗(yàn)，對一些重大技術(shù)難題，如降雨——徑流分析、臨界預(yù)警指標(biāo)的確定方法、預(yù)警信息發(fā)布等，宜選擇具有不同自然地理特征的小流域，建立山洪災(zāi)害防治小流域示范區(qū)，開展專項(xiàng)研究，并作為一項(xiàng)長期任務(wù)持續(xù)開展下去。通過不斷探索，提出上述重大技術(shù)難題的解決方案，完善后向全國推廣。

2.2 P.m 共培養(yǎng)后pHOK 細(xì)胞差異表達(dá)基因及聚類分析

聚類分析結(jié)果顯示，對照組與實(shí)驗(yàn)組的基因簇明顯分開，提示對照組和實(shí)驗(yàn)組間在整體基因表達(dá)上存在明顯差異（圖2a）。在本次測序所獲取的全部基因中，pHOK 與

.

共培養(yǎng)4 h 組與對照組間有1 788 個(gè)基因的表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，共培養(yǎng)24 h 組與對照組間有1 832 個(gè)基因的表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

無償獻(xiàn)血采血護(hù)理質(zhì)量關(guān)系到采血質(zhì)量以及獻(xiàn)血者的健康安全,需要引起足夠的重視,對于干擾和妨礙采供血的風(fēng)險(xiǎn)因素,應(yīng)采取有效的護(hù)理干預(yù)和風(fēng)險(xiǎn)控措施,進(jìn)而提高采供血質(zhì)量,為臨床醫(yī)療應(yīng)用提供支持。因此,在無償獻(xiàn)血采血護(hù)理工作當(dāng)中,應(yīng)著重加強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)評估和控制。深入到采血過程的各個(gè)步驟、環(huán)節(jié)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估,從中發(fā)現(xiàn)安全隱患[2]。

②對照組與共培養(yǎng)4 h 組之間得到的下調(diào)DEGs 富集于19 個(gè)生物過程條目中，如上皮發(fā)育（epidemis development）、皮 膚 發(fā) 育（skin develop?ment）、上皮細(xì)胞分化調(diào)節(jié)（regulation of epithelial cell differentiation）等；富集于1 個(gè)細(xì)胞成份條目中，即角質(zhì)化包膜（cornified envelope）（圖3b）。

2.3 P.m 共培養(yǎng)后pHOK 細(xì)胞差異表達(dá)基因GO 富集分析

對各組上調(diào)的DEGs 和下調(diào)的DEGs 進(jìn)行GO富集分析結(jié)果顯示：①對照組與共培養(yǎng)4 h 組之間得到的上調(diào)DEGs 富集于604 個(gè)生物過程（biologi?cal process，BP）條目中，如細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)（cellular response to lipopolysaccharide）、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)（response to molecule of bacterial ori?gin）、生物刺激的細(xì)胞反應(yīng)（cellular response to biot?ic stimulus）等；富集于12 個(gè)細(xì)胞成分（cellular com?ponent，CC）條目中，如細(xì)胞頂端部分（apical part of cell）、收縮纖維（contractile fiber）、肌節(jié)（sarcomere）等；富集于18 個(gè)分子功能（molecular function，MF）條目中，如細(xì)胞因子活性（cytokine activity）、受體配體活性（receptor ligand activity）、信號受體激活因子活性（signaling receptor activator activity）等（圖3a）。

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。以GAPDH為內(nèi)參。肌球蛋白1B（myosin1B，MYO1B）正義鏈：5’?GGAGACCATGGCCA AAATGG?3’，MYO1B 反義鏈：5’?GGTCAAAGCGCT TCTTGAGG?3’；GAPDH正義鏈：5’?GGACCTGACC TGCCGTCTAG?3’，GAP?DH 反義鏈：5’?GTAGCCCA GGATGCCCTTGA?3’。

pHOK 與

.

共培養(yǎng)4 h 組相較對照組中表達(dá)上調(diào)基因?yàn)?77 個(gè)，表達(dá)下調(diào)基因?yàn)?16 個(gè)；共培養(yǎng)24 h 組相較對照組中表達(dá)上調(diào)基因?yàn)? 012 個(gè)，表達(dá)下調(diào)基因?yàn)?28 個(gè)，兩處理組與對照組間有1 090 個(gè)共同差異表達(dá)基因（common differentially expressed genes，cDEGs）（圖2b～2d，表1）。

③對照組與共培養(yǎng)24 h 組之間得到的上調(diào)DEGs 富集的GO 通路與4 h 組在分子功能富集條目相似度高（圖3c）。

④對照組與共培養(yǎng)24 h 組之間得到的下調(diào)DEGs 富集于84 個(gè)生物過程條目中，如化學(xué)突觸傳遞的調(diào)節(jié)（modulation of chemical synaptic transmis?sion）、跨突觸信號的調(diào)節(jié)（regulation of trans?synap?tic signaling）、神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)（neurotransmitter trans?port）等；富集于21 個(gè)細(xì)胞成份條目中，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔（endoplasmic reticulum lumen）、神經(jīng)元與神經(jīng)元突觸（neuron to neuron synapse）、突觸后密集區(qū)（post?synaptic density）等；在MF 條目中沒有具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的富集（圖3d）。

2.4 P.m 共培養(yǎng)后pHOK 細(xì)胞差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析

①對照組與共培養(yǎng)4 h 組之間得到的上調(diào)DEGs 富集于33 條KEGG 通路中，顯示其與細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用（cytokine?cytokine re?ceptor interaction）、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體相互作用（viral protein interaction with cyto?kine and cytokine receptor）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路等相關(guān)（圖4a）。

②對照組與共培養(yǎng)4 h 組之間得到的下調(diào)DEGs 在KEGG 通路數(shù)據(jù)庫中沒有得到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的富集條目。

7 投稿方式 投稿請發(fā)電子郵件(郵件主題寫第一作者姓名和文題)，本刊E-mail：zacaoxuebao@163.com或zckx@jaas.ac.cn。審稿時(shí)間一般為20天左右，特別優(yōu)秀的稿件可加快處理。錄用通知將通過電子郵件通知作者，投稿后請注意查看E-mail。

為分別探究

.

對HOK 細(xì)胞系在時(shí)間梯度和濃度梯度共培養(yǎng)后造成的影響，設(shè)置時(shí)間梯度共培養(yǎng)組和濃度梯度共培養(yǎng)組，以未與菌液共培養(yǎng)的HOK 細(xì)胞作為對照組。時(shí)間梯度組每孔加入10 μL 菌液，各組共培養(yǎng)體系最終菌液濃度為5 ×10

CFU/mL，分別培養(yǎng)4 h、6 h、8 h；濃度梯度組每孔分別加入10 μL、20 μL、30 μL 菌液，各實(shí)驗(yàn)組體系中最終菌液濃度分別為：5×10

CFU/mL、10×10

CFU/mL、15×10

CFU/mL，共 培 養(yǎng)4 h。 用DMEM 培養(yǎng)基補(bǔ)足液體量，對照組只添加基礎(chǔ)DMEM 培養(yǎng)基，使各組共培養(yǎng)體系最終液體的量相同，總體積2 mL，以便計(jì)算菌液濃度。將處理后的細(xì)胞在37 ℃、5%CO

的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隨后吸去上清，PBS 輕柔洗細(xì)胞3 次，待后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

④對照組與共培養(yǎng)24 h 組之間得到的下調(diào)DEGs 在KEGG 通路數(shù)據(jù)庫中沒有得到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的富集條目。

2007年，醫(yī)院將建于1892年的巴洛克式建筑舊址改造為醫(yī)院歷史紀(jì)念館，成為醫(yī)院文化的匯聚地，后被定為省市愛國主義教育基地、對外文化交流基地。

2.5 差異表達(dá)基因肌球蛋白1B 的驗(yàn)證

在本次轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中，MYO1B 是共培養(yǎng)4 h 組、共培養(yǎng)24 h 組共有的DEG。

將相同濃度（5×10

CFU/mL）的

.

與HOK 細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)長（0、4 h、6 h、8 h），MYO1B 的mRNA 表達(dá)和蛋白表達(dá)在4、6、8 h 均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.005）。

將不同濃度的

.

（10 μL 組、20 μL 組、30 μL組最終菌液濃度分別為：5×10

CFU/mL、10×10

CFU/mL、15×10

CFU/mL）刺激HOK 細(xì)胞4 h 后MYO1B 的表達(dá)均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.005）（圖5）。

3 討 論

細(xì)菌微生物的菌群失調(diào)可能是OLP 發(fā)生發(fā)展的原因之一。本課題組前期發(fā)現(xiàn)

.

在OLP 患者頰黏膜表面構(gòu)成比增加最為顯著，而口腔上皮角質(zhì)形成細(xì)胞作為口腔黏膜抵御外界入侵的第一道防線，可能直接受

.

刺激影響。在與

.

共培養(yǎng)后，HOK 細(xì)胞在鏡下可保持完整的細(xì)胞形態(tài)并形成完整的單層細(xì)胞，

.

的刺激會(huì)降低HOK 細(xì)胞的活力，對HOK 細(xì)胞造成損傷；在對OLP 患者的口腔角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行體外分離培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)較正常人群相比，OLP 患者的口腔角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞活力明顯降低，細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生明顯變化

，本課題組建立的

.

?HOK 細(xì)胞共培養(yǎng)模型與之相似，推測

.

損傷HOK 細(xì)胞可能與OLP 臨床中發(fā)生上皮層糜爛和潰瘍有關(guān)。

玉米膜下滴灌高產(chǎn)栽培技術(shù)是覆蓋、灌溉、高產(chǎn)技術(shù)相結(jié)合的綜合技術(shù)。為了合理實(shí)施該技術(shù)，需要在種植初期進(jìn)行一系列的前期準(zhǔn)備工作，在正式實(shí)施中，中后期滴灌管網(wǎng)的布設(shè)和田間管理尤為重要，加強(qiáng)灌區(qū)灌溉管理。積極開展化肥和施肥管理，從多個(gè)方面進(jìn)行病蟲害防治，提高玉米產(chǎn)量。

目前認(rèn)為免疫失調(diào)在OLP 發(fā)病過程中起到重要作用

，多個(gè)學(xué)者報(bào)道的OLP 組織高通量測序結(jié) 果

顯 示 其 多 富 集 在 與 免 疫 相 關(guān) 的GO 與KEGG 通路如趨化因子活躍、細(xì)胞因子活躍和原發(fā)性免疫缺陷等免疫炎癥相關(guān)通路，以及與上皮發(fā)育分化、神經(jīng)受體配體作用和代謝相關(guān)的通路如表皮分化復(fù)合體

、激活神經(jīng)元的受體配體交互和酪氨酸代謝

等。有文獻(xiàn)報(bào)道OLP 組織中Toll樣受體?4（toll like receptor?4，TLR?4）的明顯高表達(dá)

，且存在多種細(xì)胞因子表達(dá)改變，如腫瘤壞死因 子α（tumor necrosis factor?α，TNF?α）表 達(dá) 升高

，白介素?23（interleukin?23，IL?23）和IL?17 過表達(dá)等

。為探究

.

對pHOK 短時(shí)間作用及較長時(shí)間作用的影響，并探究

.

刺激與OLP 發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)聯(lián)，本研究進(jìn)一步將

.

與pHOK 共培養(yǎng)后4 h和24 h進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，研究結(jié)果顯示，

.

刺激pHOK 細(xì)胞后，炎癥相關(guān)通路如IL?17 信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、Toll 樣受體通路、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體互作等在兩處理組中均明顯富集，其他KEGG 通路如上皮發(fā)育、跨突觸信號調(diào)節(jié)等也有較明顯富集，而這些通路與既往報(bào)道的OLP 轉(zhuǎn)錄組測序的富集通路有明顯重合。

本 研 究 結(jié) 果 顯 示，

.

與pHOK 共 培 養(yǎng)4 h 組GO 通路明顯富集在細(xì)胞頂端部分（apical part of cell）和頂端質(zhì)膜（apical plasma membrane）這兩個(gè)細(xì)胞成分中。單個(gè)上皮細(xì)胞之間的空間密封由頂端連接復(fù)合物（apical junctional complex）執(zhí)行，其包含緊密連接、黏附連接和橋粒

。細(xì)胞黏附建立后，緊密連接通過其蛋白質(zhì)組分將空間密封起來

。本課題組推測，在

.

刺激pHOK 細(xì)胞早期，pHOK 細(xì)胞的細(xì)胞頂端部分和頂端質(zhì)膜的頂端連接復(fù)合物成分合成加強(qiáng)，以增強(qiáng)細(xì)胞間緊密連接，抵抗外界細(xì)菌侵入。

本研究結(jié)果顯示，MYO1B 是pHOK 與

.

共培養(yǎng)4 h、24 h 組均上調(diào)表達(dá)的差異基因。MYO1B 即肌球蛋白1B，肌球蛋白是一種以ATP 調(diào)節(jié)的方式結(jié)合到肌動(dòng)蛋白的蛋白質(zhì)，與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合促進(jìn)肌球蛋白水解ATP，從而為肌動(dòng)蛋白絲的運(yùn)動(dòng)提供動(dòng)力

。肌動(dòng)?肌球蛋白的收縮是細(xì)胞骨架改變的形式之一，肌動(dòng)蛋白?肌球蛋白環(huán)也是組成細(xì)胞緊密連接的重要部分，肌動(dòng)蛋白?肌球蛋白環(huán)在維持上皮極性和上皮屏障功能中發(fā)揮了重要作用

。Lv 等

報(bào)道，肌球蛋白ⅡA（myosin?ⅡA）調(diào)控缺氧低糖腦內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接，抑制肌球蛋白ⅡA 可減弱claudin?5 和ZO?1 等緊密連接蛋白的形態(tài)變化；Omelchenko 等

報(bào)道，在整體遷移的細(xì)胞中，肌球蛋白ⅨA（myosin?ⅨA）的敲除導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的改變，細(xì)胞?細(xì)胞間黏附被破壞，導(dǎo)致細(xì)胞分散。以上這些實(shí)驗(yàn)表明，肌球蛋白家族通過細(xì)胞骨架與緊密連接調(diào)節(jié)了上皮細(xì)胞屏障。本研究結(jié)果顯示，

.

濃度梯度對MYO1B 表達(dá)的影響更為明顯，提示菌群數(shù)量的失衡對緊密連接有較大影響。這與本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在OLP患者頰黏膜表面菌群失調(diào)相印證。此外，文獻(xiàn)報(bào)道MYO1B 參與了舌部鱗狀細(xì)胞癌等多種腫瘤的發(fā)展與轉(zhuǎn)移，且預(yù)示了較差的預(yù)后以及隱匿性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

。提示MYO1B 可能參與了OLP 惡變。

綜上，本研究對與

.

共培養(yǎng)4 h 和24 h 的pHOK 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，研究發(fā)現(xiàn)

.

和pHOK 共培養(yǎng)過程中IL?17 信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、Toll 樣受體通路等KEGG 通路明顯富集，對脂多糖的反應(yīng)、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、細(xì)胞頂端部分等GO 通路明顯富集，提示

.

對口腔角質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組存在重要影響，其中MYO1B 可能在細(xì)菌?細(xì)胞相互作用中發(fā)揮了重要作用。本研究為進(jìn)一步揭示OLP 的發(fā)病機(jī)制提供了相關(guān)的研究基礎(chǔ)。

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