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    豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的研究

    2013-11-12 07:04:18王艷萍曾維斌楊順邦賀昌萍
    關(guān)鍵詞:卵母細(xì)胞培養(yǎng)液卵泡

    王艷萍 曾維斌 楊順邦 賀昌萍

    (塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 阿拉爾 843300)

    隨著胚胎工程技術(shù)的研究與應(yīng)用,卵母細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料,對(duì)其需求量也越來越大,因此,建立并完善卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)(IVM,in vitro maturation)體系可為研究胚胎發(fā)育生物學(xué)、iPS、人類器官移植以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、核移植等技術(shù)的研究提供材料保障。卵母細(xì)胞成熟是指卵母細(xì)胞恢復(fù)和完成第一次減數(shù)分裂,進(jìn)入并停滯于第二次減數(shù)分裂中期(MⅡ),此間伴隨核成熟和胞漿成熟兩個(gè)方面,核成熟是核膜破裂,同源染色體分離和排出第一極體,胞漿成熟是胞漿內(nèi)各種蛋白組成達(dá)到一定水平及線粒體的有效重排[1]。在體內(nèi)卵母細(xì)胞是在卵泡內(nèi)發(fā)育成熟的,卵泡大小對(duì)卵母細(xì)胞的成熟及受精后發(fā)育潛力起著至關(guān)重要的作用,促卵泡素(FSH)與促黃體素(LH)是參與卵母細(xì)胞成熟的最重要的蛋白質(zhì)激素,可促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖、膨散,LH 與受體結(jié)合,可促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟,大大提高體外培養(yǎng)成熟率[2]。因此,本實(shí)驗(yàn)利用屠宰場(chǎng)廢棄的豬卵巢采集的卵母細(xì)胞,研究卵泡液、激素和卵泡大小對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)的影響,為進(jìn)一步的科學(xué)研究提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 成熟培養(yǎng)液的基礎(chǔ)液配制

    以TCM199+10% FCS 為基礎(chǔ),添加3.05 mMol/L葡萄糖、0.91mMol/L丙酮 酸 鈉、0.57 mMol/L L- 半胱氨酸、75μg/ml 青霉素、50 ug/mL鏈霉素,定容、過濾、分裝,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    FSH (促卵泡素)、LH (促黃體素)、PMSG (孕馬血清促性腺激素)是寧波激素制品廠生產(chǎn),其它試劑如未特別注明,均購自Sigma 公司。

    1.2 豬卵泡液的制備

    用10 mL 注射器帶12 號(hào)針頭,從卵巢表面直徑4~7 mm的卵泡中抽取豬卵泡液。抽取的卵泡液放入1.5 mL 離心管中,2 000 rpm 離心20 min,取上清液于0.22 um的濾器過濾后,分裝并儲(chǔ)存于-20℃冰箱中備用。

    1.3 卵母細(xì)胞的獲得

    從屠宰場(chǎng)采集新鮮豬卵巢,保存在加青、鏈霉素的不低于30℃的生理鹽水中,2h 內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。卵巢經(jīng)無菌的生理鹽水中洗3 遍,用帶12 號(hào)針頭的注射器(10 mL)抽取卵巢表面的卵泡液,靜置、棄上清液后在體視顯微鏡下?lián)炻选V晃、B 級(jí)的COCs(卵丘-卵母細(xì)胞),再經(jīng)mTCM199 液洗3 次后,放置在成熟培養(yǎng)液液滴中進(jìn)行培養(yǎng)。

    1.4 卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)分組

    實(shí)驗(yàn)1 以TCM199 +10% FCS(胎牛血清)為主的基礎(chǔ)液為對(duì)照組。再添加不同濃度5%、10%、20%的豬卵泡液。

    實(shí)驗(yàn)2 以TCM199 +10% FCS+10% PFF(豬卵泡液)做對(duì)照組。再添加50 ug/ml FSH、LH、PMSG。

    實(shí)驗(yàn)3 根據(jù)實(shí)驗(yàn)2 確定的最優(yōu)成熟培養(yǎng)液后,根據(jù)卵泡直徑的大小將其劃分為≤3 mm、4~7 mm和≥8 mm 三個(gè)等級(jí),然后分別用吸取卵泡中的卵母細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

    1.5 卵母細(xì)胞的體外成熟

    將含有不同培養(yǎng)液的COCs的液滴培養(yǎng)皿放在5%CO2的空氣、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。44 h 后將COCs 置于實(shí)體顯微鏡下觀察卵母細(xì)胞是否有第一極體的排出,以此作為判斷成熟的標(biāo)準(zhǔn)。

    1.6 數(shù)據(jù)處理

    試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS 單因素方差分析,試驗(yàn)重復(fù)數(shù)為6 次。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 添加不同水平的豬卵泡液對(duì)COCs 成熟的影響

    從表1 可以看出,添加10%豬卵泡液的試驗(yàn)C組,其卵母細(xì)胞的成熟率要顯著(P<0.05)高于分別添加對(duì)照組、5%與20% PFF的試驗(yàn)組,B、D 組之間差異不顯著,但其成熟率也要高于(P<0.05)對(duì)照組。故實(shí)驗(yàn)2 將以C 組液為對(duì)照組。

    表1 豬卵泡液不同添加水平對(duì)COCs 成熟的影響

    2.2 添加不同種類的激素對(duì)COCs 成熟的影響

    由表2 可以看出,B 組添加50 ug/ml FSH的卵母細(xì)胞成熟率最高,顯著高于(P<0.05)其它三組。添加50 ug/ml LH的C 組和添加50 ug/ml PMSG的D 組之間差異不顯著,但均顯著高于(P<0.05)對(duì)照組。

    表2 添加不同種類的激素對(duì)COCs 成熟的影響

    2.3 不同直徑卵泡對(duì)COCs 成熟的影響

    由表3 可以看出,來自于直徑4~7 mm 大小卵泡的卵母細(xì)胞,在相同培養(yǎng)條件下其成熟率顯著高于(P<0.05)≤3 mm 和≥8 mm的實(shí)驗(yàn)組。卵泡直徑≥8 mm 實(shí)驗(yàn)組顯著高于(P<0.05)≤3 mm的實(shí)驗(yàn)組。

    表3 不同直徑卵泡對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響

    3 討論

    哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞在體外成熟中,卵泡液是重要的影響因素之一。豬卵泡液是卵泡中血清滲出物經(jīng)過新陳代謝活動(dòng)改變過的產(chǎn)物,包含有特殊成分,如卵泡壁細(xì)胞合成的類固醇和糖蛋白,卵泡液對(duì)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育有促進(jìn)作用。劉曉輝等人[3]在TCM199 與NCSU-23 為主的培養(yǎng)液中添加豬卵泡液的對(duì)比試驗(yàn)中,添加組都比對(duì)照組顯著提高了卵母細(xì)胞的培養(yǎng)成熟率。而本試驗(yàn)設(shè)計(jì)不同添加水平的豬卵泡液培養(yǎng)卵母細(xì)胞,證明添加濃度為10%的豬卵泡液能更好地促進(jìn)豬卵母細(xì)胞的成熟。

    在卵母細(xì)胞體外成熟過程中,激素是促進(jìn)胞質(zhì)成熟的重要成分。秦鵬春[4]等認(rèn)為,F(xiàn)SH 和LH 對(duì)豬卵母細(xì)胞IVM 和排卵起到主要作用,Shimada[5]等認(rèn)為前20 h 添加FSH+LH,而后20 h 不添加FSH+LH,IVM 效果更好。馬紅[6]在研究促卵泡素對(duì)奶牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),一旦在成熟培養(yǎng)液中添加FSH,卵母細(xì)胞的成熟率也立刻上升,而通過不同濃度的對(duì)比發(fā)現(xiàn),隨著FSH 濃度上升,卵母細(xì)胞成熟率也隨之上升,F(xiàn)SH 濃度最終決定了成熟卵母細(xì)胞的數(shù)目,當(dāng)濃度達(dá)到50 ug/ml 時(shí)在促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟方面具有最佳作用。故本試驗(yàn)采用了這一劑量來研究單獨(dú)使用不同激素添加物對(duì)IVM的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)FSH 對(duì)豬卵母細(xì)胞成熟的效果更優(yōu)。

    卵泡作為哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞生長(zhǎng)和成熟的環(huán)境,其對(duì)卵母細(xì)胞的成熟起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。卵泡直徑為0.5~1.6 mm 小卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞正進(jìn)行RNA的合成,而大卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞已貯存了足夠的RNA 以分成蛋白質(zhì),故大卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞的體外成熟率高。Yoon 等[7]研究發(fā)現(xiàn)3-8 mm 直徑卵泡的卵母細(xì)胞成熟率顯著高于小于3 mm 卵泡的卵母細(xì)胞。豬卵泡直徑過大或過小,卵母細(xì)胞成熟能力均降低。大卵泡內(nèi)的細(xì)胞已成熟或過成熟,小卵泡內(nèi)細(xì)胞卻未發(fā)育成熟,只有3~5 mm 組卵泡的卵母細(xì)胞是生長(zhǎng)旺盛期適宜IVM[8]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,來自于直徑4~7 mm 大小卵泡的卵母細(xì)胞,在相同培養(yǎng)條件下其成熟率顯著高于(P<0.05)≤3 mm 和≥8 mm的實(shí)驗(yàn)組。該結(jié)果與華冉東等人[9]的試驗(yàn)認(rèn)為來自豬卵泡3~6 mm的卵母細(xì)胞培養(yǎng)成熟率最好的結(jié)果相似。

    [1]Michelson A L.In vitro maturation of human oocytes[J].Intern Congre Series,2004,1266:160-166.

    [2]周洪彬,肖雄,包磊,等.豬體外胚胎生產(chǎn)的研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,39(7):1457-1463.

    [3]劉曉輝,曹陽,郎洪彥,等.培養(yǎng)液對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟及孤雌胚胎早期體外發(fā)育的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(20):12229-1223.

    [4]秦鵬春,譚景和,吳光明,等.豬卵母細(xì)胞體外成熟和受精的研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),1995,28(3):58-66.

    [5]Shimada M.Terada T.FSH and LH induce progesterone production and progesterone receptor synthesis in cumulus cells:a requirement for meiotic resumption in porcine oocytes[J].Molecula Human reproduction,2002,8(7):612-618.

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    [9]華再東,鄭新民,魏慶信,等.豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響因素[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,30 (3):280-284.

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