綿羊角蛋白中間絲基因KIF1.2的克隆及序列分析

劉 鑫 姜仁軍 王 成 李樹偉，*

(1 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300)(2 塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾843300)

羊毛是羊皮膚的衍生物，羊毛的品質(zhì)主要決定于羊毛皮質(zhì)內(nèi)的毛纖維。羊毛纖維具有高度的組織結(jié)構(gòu)，角蛋白及其關(guān)聯(lián)蛋白是其構(gòu)成的主要組成成分。角蛋白相關(guān)蛋白基因(keratin associated proteins，KAP)是編碼毛發(fā)纖維組成蛋白的一種結(jié)構(gòu)基因，由多基因家族編碼［1］。它與羊毛纖維的品質(zhì)密切相關(guān)。同時(shí)也與遺傳，營養(yǎng)、生理及環(huán)境等因素有關(guān)。不同地區(qū)、不同品種絨山羊所產(chǎn)生的羊絨有明顯的品質(zhì)差異［2］。羊毛纖維的90%是由角蛋白中間絲(Keratin intermediate filament，KRT－IF)和角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白(Keratin associated proteins，KAPs)所構(gòu)成。要提高羊毛品質(zhì)的關(guān)鍵問題是要調(diào)控決定羊毛品質(zhì)的基因，特別是毛囊角蛋白基因是如何發(fā)生基因表達(dá)來參與羊毛性狀的調(diào)控等這些復(fù)雜因素和相關(guān)基因位點(diǎn)及相互之間的關(guān)系還不很清楚。當(dāng)前，科學(xué)家們的研究熱點(diǎn)主要是針對(duì)構(gòu)成羊毛纖維的角蛋白中間絲(Keratin intermediate filament，KRT－IF)和角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白(Keratin associated proteins，KAPs)的相關(guān)基因的研究上［3］。

目前，大部分研究都集中在對(duì)毛囊KAPs 基因家族多態(tài)性的課題研究上，對(duì)一個(gè)品種的單個(gè)基因的深入研究并不多。因此，本研究以南疆地方品種羊和田羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物，以KIF1.2 角蛋白中間絲基因?yàn)檠芯繉?duì)象，成功克隆KIF1.2 基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，旨在為深入探討綿羊毛囊KIF1.2 基因的表達(dá)對(duì)綿羊性狀的影響提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本

本課題組在動(dòng)物試驗(yàn)站飼養(yǎng)的和田羊平原型和山區(qū)型，樣品的總RNA的由本課題組提供，儲(chǔ)存于－80℃冰箱中備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

智能型熱循環(huán)儀PCR 儀(IcyclerTM Thermal Cycler)、移液器(Eppendorf)等。臺(tái)式小型高速離心機(jī)(MIKR0120)，電泳儀(Bio－ RAD)，凝膠分析系統(tǒng)(GELDOC2000)，低溫高速冷凍離心機(jī)(德國SIGMA)，蛋白電泳儀(北京六一儀器廠)，高壓滅菌鍋(HVE50)。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

ExTaq 酶、限制性內(nèi)切酶EcoR I、Nde I、RNase Inhibitor、dNTP、DNA Maker(DL2000 和DL15000)均購自TaKaRa 寶生物工程(大連)有限公司。UNIQ－10 柱式DNA 膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自北京天根生物有限公司。氯仿、TEMED、異戊醇、異丙醇、MgCl2、NaCl、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.4 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、克隆載體pMD18－T 為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.5 角蛋白中間絲基因KIF1.2的PCR 擴(kuò)增

1.5.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

和田羊毛囊角蛋白中間絲KIF1.2 基因PCR 引物的設(shè)計(jì)與合成參照GenBank 中公布的普通綿羊基因序列KIF1.2(M23912.1)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，上游引物(P1):5’－CATATGTCTTTCAACTTCTGCC－3’，下游引物(P2):5’－GAATTCCTGGTGCACAAAGGTGTTGC－3’。預(yù)期擴(kuò)增的片段大小為1215 bp。引物由生工生物工程(上海)技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.5.2 KIF1.2 基因的PCR 擴(kuò)增

以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 第一鏈為模板，PCR 擴(kuò)增KIF1.2 基因。反應(yīng)體系25 μl，其中，模板DNA 1 μl，上下游引物各為0.5 μl(10 μΜ)，Ex Taq 酶0.2 μl(5 U/μl)，dNTP 0.5 μl，10 × TaqBuffer 2.5 μl，ddH2O 18.9 μl。反應(yīng)條件為94℃10 min;94℃45 s，退火溫度45 s，72℃1 min，35 個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min 。擴(kuò)增片段大小為1215 bp。目的基因的回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定均按常規(guī)方法操作［4］。取5 μl的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，將擴(kuò)增的單一目的條帶進(jìn)行回收。所有PCR 純化回收后的產(chǎn)物于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 KIF1.2 基因PCR 擴(kuò)增體系

1.5.3 PCR 產(chǎn)物和載體的連接與鑒定

將回收的角蛋白中間絲KIF1.2 目的基因PCR產(chǎn)物定向連接到pMD18－T 載體上，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，將經(jīng)過PCR 鑒定的陽性質(zhì)粒DNA 用Nde I 和EcoR I 雙酶切鑒定，將上述鑒定所得到的陽性重組子送至生工生物工程(上海)有限公司測定序列。

1.5.4 序列分析

序列同源性分析采用DNAMAN 軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 目的片段的擴(kuò)增結(jié)果分析

對(duì)提取的和田羊山區(qū)型和平原型皮膚毛囊總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，通過PCR 擴(kuò)增，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。(圖1)可見在1215 bp 處有明亮的特異性條帶，陰性對(duì)照無條帶，結(jié)果顯示片段的大小和預(yù)期的結(jié)果一致，初步表明正確的擴(kuò)增基因的目的片段。

圖1 KIF1.2 基因目的片段PCR 擴(kuò)增

2.2 重組質(zhì)粒的PCR 檢測及酶切鑒定

將初步鑒定出來的質(zhì)粒DNA 為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增并用NdeI 和EcoR I 雙酶切檢測(山區(qū)型)，均獲得了大小為1215 bp的單一明亮條帶(圖2，圖3)

2.3 測序結(jié)果

圖2 KIF1.2 基因重組質(zhì)粒PCR 電泳

通過DNAMAN 軟件將質(zhì)粒測序的結(jié)果與Gen-Bank KIF1.2(M23912.1)進(jìn)行對(duì)比分析表明，該序列全長1215 bp 大小，其中共有三處堿基突變，分別是915 bp 處T 突變?yōu)镃，1136 bp 處G 突變?yōu)锳，1139 bp 處A 突變?yōu)镚，同源性為99%，說明該序列呈現(xiàn)高度的保守性，KIF1.2 基因克隆成功。

圖3 KIF1.2 基因重組質(zhì)粒酶切鑒定(山區(qū)型)

圖4 KIF1.2 基因序列比對(duì)圖

3 討論

綿羊羊毛是畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)的主要支柱，新疆作為我國重要的綿羊生產(chǎn)基地之一，細(xì)羊毛產(chǎn)業(yè)在國內(nèi)處于領(lǐng)先地位，南疆地方品種羊和田羊其毛被兩型毛多，長而均勻，毛的彈性、光澤和潔白度較好，是紡織工業(yè)的優(yōu)質(zhì)原料。但和田羊也存在體格較小，產(chǎn)毛量、產(chǎn)肉率和繁殖率不高等缺點(diǎn)。近些年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，綿羊羊毛的性狀研究已經(jīng)進(jìn)入了分子遺傳水平階段，也一直是國內(nèi)外很多專家學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

對(duì)于角蛋白及其關(guān)聯(lián)蛋白的研究，科學(xué)家們對(duì)人，小鼠，綿羊的毛囊角蛋白及其關(guān)聯(lián)蛋白研究得比較多，山羊的毛發(fā)角蛋白及其關(guān)聯(lián)蛋白基因也有相關(guān)的報(bào)道［5，6］。到目前為止，科學(xué)家們估計(jì)角蛋白的數(shù)量大約在100 個(gè)，因?yàn)榻堑鞍准捌浼易宄蓡T的大小和電荷都很相似，目前單一的電泳技術(shù)很難將所有的蛋白都分離出來。角蛋白中間絲蛋白KIF 包括兩個(gè)家族，即酸性(I 型)和堿性(Ⅱ型)角蛋白，脊椎動(dòng)物的KIF 由50 多個(gè)基因編碼，在毛囊發(fā)育過程中，I 型和Ⅱ型共聚構(gòu)成約10 nm的微絲纖維，充滿基質(zhì)角蛋白形成微絲束［7］。據(jù)報(bào)道，角蛋白中間絲I 型Ⅱ型基因家族在基因組中并不是緊密連鎖，I 型Ⅱ型基因是成簇分布的，并且角蛋白Ⅱ型可能含有保守的不同于上皮細(xì)胞的C 端結(jié)構(gòu)域［8］。

利用綿羊毛囊毛角蛋白和角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白基因，通過基因技術(shù)改變羊毛纖維的蛋白組成，可以產(chǎn)生更加優(yōu)良的纖維類型。編碼羊毛I(xiàn) 型中間絲角蛋白KIF1.2 基因包括兩端500 bp的DNA 側(cè)翼，測序表明其原始轉(zhuǎn)錄本長度為5180 bp，具有7 個(gè)外顯子［9］。高水平皮質(zhì)特異性表達(dá)羊毛I(xiàn)I 型角蛋白中間絲基因KIF，能夠顯著改善羊毛纖維的微觀結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)基因羊毛纖維表現(xiàn)色澤亮而且彎曲度降低。同時(shí)，過度表達(dá)K2.10的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物構(gòu)成大多數(shù)的II型中間絲蛋白不能和許很多表達(dá)的內(nèi)源性角蛋白I型中間絲構(gòu)成異二聚體［10］。與非轉(zhuǎn)基因的羊毛纖維相比較，轉(zhuǎn)基因羊的纖維皮層細(xì)胞中很難找到中間絲微纖維。最終對(duì)纖維結(jié)構(gòu)的影響效果是，擾亂了纖維皮質(zhì)中正皮質(zhì)與副皮質(zhì)細(xì)胞的組成，能造成纖維彎曲度降低的因素之一。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)參照GenBank 中公布的普通綿羊基因序列設(shè)計(jì)合成了和田羊毛囊中間絲角蛋白KIF1.2 基因引物，以南疆地方品種和田羊毛為實(shí)驗(yàn)材料，應(yīng)用PCR 法成功獲得了中間絲角蛋白KIF1.2基因的成熟編碼序列。經(jīng)生物信息學(xué)分析，序列全長大小為1215 bp，有三處堿基發(fā)生突變，分別是915 bp 處T 突變?yōu)镃，1136 bp 處G 突變?yōu)锳，1139 bp 處A 突變?yōu)镚，同源性為99%。表明該序列呈現(xiàn)高度的保守性。中間絲角蛋白KIF1.2 基因的克隆為進(jìn)一步構(gòu)建表達(dá)載體以及制備其多克隆抗體提供了基礎(chǔ)依據(jù)，從而為深入研究南疆地方品種綿羊角蛋白家族基因的定位，以及對(duì)羊毛性狀的調(diào)控機(jī)制等方面提供理論指導(dǎo)。

［1］Mclaren R J，Rogers G R，Davies K P，et.Linkage mapping of wool keratin and keratin associated protein genes in sheep ［J］.Mammalian Genome，1997，8(12):938－940.

［2］M Zhao，H Chen，Wang，et.PCR－SSCP and DNA sequencing detecting two silent SNPs atKAP8·1 gene in the cashmere goat［J］.MolBiol Rep，2008，7(3):10－16.

［3］肖西山，姚軍，王利智.中國細(xì)毛養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1998，7(3):90－93.

［4］Sambrook J，Russell D W.Molecular cloning:a laboratory manual［J］.New York;Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001，2(9):31－37.

［5］尹俊，扈廷茂，李金泉.內(nèi)蒙古蒙古絨山羊6 個(gè)與相似綿羊KAP6－1的cDNAs的克隆及特征分析［J］.遺傳學(xué)報(bào)，2004，31(5):502－507.

［6］姚毅.兩個(gè)細(xì)毛羊品種羊毛細(xì)度及產(chǎn)量性狀的分子遺傳標(biāo)記研究:［碩士學(xué)位論文］.陜西楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué)，2006，20(5):70－76.

［7］Powell B C，Rogers G E.The role of keratin in protein and their genes in the growth，structure and properties of hair［J］.In:Formation and Structure of Human Hair。Basel:Birkha user verlag，1997，(7)2:99－145.

［8］Powell B C，Rogers G E.Cyclic hair－loss and regrowth in transgenic mice overexpressing an intermediate filamentgene［J］.The EMBO Journal，1990，9 (5):1485－1493.

［9］William B M D，Donw F M D.A Textbook of histology［J］.10 ed.Philadelphia，London，Toronto:W B Company，1975，21(6):29－37.

［10］Porter R M，Lane E B.Phenotypes，genotypes and their contribution to understanding keratin function［J］.Trends Genet，2003，19(3):92－115.