腸內(nèi)生態(tài)營養(yǎng)對創(chuàng)傷后大鼠腸屏障功能的影響

蔣靖志 王 琦 張燕燕

(蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 江蘇 蘇州 215009)

1 研究資料和研究方法

1.1動物分組和試劑

本次研究的大鼠隨機選取30只，大鼠需要選擇健康清潔級8周齡左右，有動物質(zhì)量合格證的Wistar大鼠，其中雌鼠15只，雄鼠15只，體質(zhì)量180～260g。按隨機數(shù)字法將大鼠分為對照組(Control)10只、腸內(nèi)普通營養(yǎng)組(EN)10只、腸內(nèi)生態(tài)營養(yǎng)組(EIN)10只。

1.2大鼠模型制作和處理

采用無菌手術(shù)的方式對大鼠進行胃造瘺模型的建設(shè)，這個手術(shù)一般在對大鼠進行2天適應(yīng)性喂養(yǎng)后做，術(shù)后大鼠的居住環(huán)境要求溫度22°C～26°C、濕度40%～-70%，并且要通風(fēng)、安靜、單獨飼養(yǎng)。手術(shù)結(jié)束后開始給予對照組大鼠喂養(yǎng)正規(guī)大鼠專用飼料，給腸內(nèi)普通營養(yǎng)組、腸內(nèi)生態(tài)營養(yǎng)組經(jīng)胃造瘺管給予腸內(nèi)營養(yǎng)液，在等氮等熱量情況下，給腸內(nèi)普通營養(yǎng)組瑞素，給腸內(nèi)生態(tài)營養(yǎng)組瑞能，大鼠喂養(yǎng)的能量需要維持在I037kJ/(kg·d)。注入量逐日遞增，第1天注入1/2，在第二天時需要將注入量調(diào)整為2/3，然后在第3-7天時大鼠的注入量為完整注入量，在對大鼠喂養(yǎng)一周后，將大鼠處死取出大鼠的末端回腸標(biāo)本，進行檢測。

1.3檢測方法和指標(biāo)

1.3.1病理學(xué)檢測

在常規(guī)光鏡下對大鼠的腸粘膜形態(tài)結(jié)構(gòu)進行詳細的觀察，這個腸粘膜是經(jīng)過HE化染色后小腸組織中的腸粘膜。腸粘膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方式是通過在每組研究大鼠的末端回腸標(biāo)本上截取不連續(xù)性的5張切片，對于每張切片采取奇數(shù)的觀察順序，觀察每張切片上的20個絨毛，測量相關(guān)形態(tài)參數(shù)。

1.3.2腸黏膜lgA+、CD3+、CD4+、CD8+細胞檢測

免疫組在通過染色后的鏡下觀察，其棕黃色為陽性細胞，具有細胞質(zhì)豐富、體積大特點。然后每張切片上需要選取5個方位的視野角，通過高倍鏡進行觀察，對每個視野的平均lgA+、CD3+、CD4+、CD8+細胞數(shù)量進行計算。

1.3.3腸內(nèi)營養(yǎng)液和檢測試劑

在FreseniusKabi—華瑞公司購入腸內(nèi)營養(yǎng)液，瑞能(Supportan)和瑞素(Fresubin)。每100ml瑞能添加0.625g精氨酸，促進瑞能每100ml蛋白質(zhì)由5.85g增至6.475g，熱量由130kcal增至132.75keal。于Serotee公司購入小鼠抗大鼠CD3+、CD4+、CD8+抗體試劑，于Rockland公司購入山羊抗大鼠IgAot重鏈特異性抗體，于北京中杉生物技術(shù)公司購入SP系列試劑盒和相關(guān)二抗試劑。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1大鼠手術(shù)完成情況

參與研究的30只大鼠，實際有效實驗數(shù)量為27只，其中一只普通營養(yǎng)組大鼠于術(shù)后6h不明原因死亡；并且在實驗中有兩只大鼠出現(xiàn)術(shù)后胃造口脫出或者堵塞導(dǎo)致臨床實驗研究出現(xiàn)無效，這兩只大鼠分別為普通營養(yǎng)組和免疫營養(yǎng)組各占有1例。通過對比在手術(shù)結(jié)束后大鼠的皮毛的光澤程度、皮毛的顏色、毛發(fā)的密集程度以及毛發(fā)的清潔度等發(fā)現(xiàn)，免疫營養(yǎng)組大鼠各方面明顯優(yōu)于對照組；在手術(shù)后大鼠出現(xiàn)腹瀉的情況，普通營養(yǎng)組和免疫營養(yǎng)組均明顯的高于對照組；本次研究的并發(fā)癥比較不存在差異性，究其原因是由于本次研究的大鼠樣本較少，導(dǎo)致在手術(shù)結(jié)束后大鼠的并發(fā)癥發(fā)生率較低。

2.2小腸粘膜形態(tài)參數(shù)測定

對于大鼠手術(shù)后的小腸黏膜的形態(tài)進行觀察發(fā)現(xiàn)，在顯微鏡下大鼠的腸壁層次能夠清晰的展現(xiàn)出來，且在本次研究中的大鼠上皮組織均正常，沒有其他的癥狀。從腸黏膜絨毛高度、黏膜厚度、腺隱窩深度和絨毛表面積四個方面進行研究，將普通營養(yǎng)組、免疫營養(yǎng)組、對照組進行對比之后可以發(fā)現(xiàn)，普通營養(yǎng)組和免疫營養(yǎng)組數(shù)值要高一些，詳情請見表1。

表1 三組大鼠小腸黏膜形態(tài)參數(shù)比較

2.3小腸黏膜中l(wèi)gA+、CD3+、CD4+、CD8+細胞數(shù)量

通過小腸黏膜中T淋巴細胞數(shù)量對比小腸黏膜中l(wèi)gA+、CD3+、CD4+、CD8+細胞的數(shù)量(細胞數(shù)/高倍視野)，發(fā)現(xiàn)免疫組化染色后，lgA+、CD3+、CD4+、CD8+細胞胞漿呈棕黃色，細胞核呈深藍色，陽性細胞在粘膜層里面。這樣結(jié)果可以看出，在陽性細胞數(shù)量對比上，對照組比兩組營養(yǎng)組少，免疫營養(yǎng)組則高于對照組和普通營養(yǎng)組(P<0.05)，如表2。

表2 四組大鼠小腸黏膜中T淋巴細胞的數(shù)量細胞數(shù)量(個)

根據(jù)實驗結(jié)果表明，要想使大鼠腸道內(nèi)粘膜屏障恢復(fù)，可以在EN液中添加能夠增強營養(yǎng)提升免疫力的營養(yǎng)物質(zhì)，這樣可使腸道局部CD3+、CD4+、CD8+T以及l(fā)gA+等細胞的數(shù)量出現(xiàn)顯著的提升，增強機體免疫力。本次實驗中采用的瑞能腸內(nèi)免疫營養(yǎng)劑，其中有數(shù)種免疫營養(yǎng)成分，因此該營養(yǎng)劑對于大鼠的腸道以及機體的免疫力提高具有較為顯著的效果。研究結(jié)果表明給術(shù)后大鼠給予的各種營養(yǎng)劑對小腸絨毛高度、粘膜厚度、腺隱窩深度以及絨毛表面積都比對照組要優(yōu)秀。腸道內(nèi)分泌物中免疫球蛋白是最為旺盛的，在免疫功能這塊發(fā)揮著重要作用。ω>3PUFA對于細胞膜的流動性、細胞膜信使傳遞和細胞膜上的受體功能具有較大的影響性，這主要是由于其對于細胞結(jié)構(gòu)的改變，而這種改變能夠直接的降低炎性遞質(zhì)性遞質(zhì)前列腺素E2(PGE)的形成，并且對于降低IL-1和TNF等細胞因子的產(chǎn)生能夠較好的對機體細胞免疫功能抑制炎癥反應(yīng)進行把控。中鏈三酰甘油(MCT)對于長鏈三酰甘油造成的肝脂肪堆積和膽汁淤積情況具有較好的改善性效果，因此能夠有效的降低肝網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的損害，減輕ω6脂肪酸衍生物血栓素的強烈收縮血管和促血小板聚集的作用。Kono等通過實驗發(fā)現(xiàn)在大鼠腸道的表達中MCT對于分泌型lgA+具有較好的提升性。創(chuàng)傷后大鼠在給予腸內(nèi)免疫營養(yǎng)后對腸粘膜屏障功能進行了改善和提高，體內(nèi)免疫細胞和免疫體液功能增強，能有效減少炎癥因子，促進術(shù)后恢復(fù)。

3 討論

通過實驗證明，當(dāng)我們的腸道長時間處于饑餓狀態(tài)，腸上皮就會出現(xiàn)菱縮，或者脫落現(xiàn)象。實驗中采用的對照組，組內(nèi)大鼠均由普通大鼠飼料喂養(yǎng)，缺乏維持氮平衡和蛋白質(zhì)合成的相應(yīng)底物，會使大鼠出現(xiàn)腸道障礙。而普通腸內(nèi)營養(yǎng)組和腸內(nèi)生態(tài)營養(yǎng)組，在進行喂養(yǎng)時平衡了氮，并添加了腸內(nèi)營養(yǎng)制劑，實驗結(jié)果是這兩組大鼠的小腸絨毛高度、黏膜厚度、腸腺隱窩深度、絨毛表面積優(yōu)于對照組(P<0.05)，這說明腸內(nèi)營養(yǎng)能夠有效減少應(yīng)激反應(yīng)對機體腸道粘膜的損傷。免疫營養(yǎng)組與普通營養(yǎng)組無顯著差異(P>0.05)，說明腸道上皮營養(yǎng)可以通過腸內(nèi)營養(yǎng)供給，無論何種營養(yǎng)都能保護腸上皮。實驗結(jié)果中可以看到，腸內(nèi)營養(yǎng)的供給，尤其是腸內(nèi)免疫營養(yǎng)供給，能夠提高腸道黏膜lgA+、CD3+、CD4+、CD8+細胞數(shù)量，隨之大鼠腸道粘膜免疫屏障重啟，大大提高了免疫力。