黃芩對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠血糖血脂的作用及其機(jī)理研究

★ 曾治君 凌美婷 朱鑫輝 劉紅寧 嚴(yán)小軍 吉燕華（江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論分化發(fā)展研究中心/江西省中醫(yī)病因生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330004）

肥胖已經(jīng)成為日常生活中的常談話題［1］，一定程度上對(duì)人民的精神造成了影響［2］，肥胖也成為糖尿病發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［3］。為此，如何有效防控肥胖成功為了大家亟待解決的問題［4］。肥胖的發(fā)生過程往往伴隨糖脂紊亂［5］，為此，從藥物的開發(fā)角度，主要是針對(duì)降糖和降脂藥物的開發(fā)，而西藥的傳統(tǒng)研究思路是單一靶點(diǎn)小分子藥物的設(shè)計(jì)與驗(yàn)證［6］，但是中藥從一開始的臨床應(yīng)用，都是多成分多靶點(diǎn)的應(yīng)用方式，對(duì)多種因素可以造成的肥胖來說，無疑有著巨大的調(diào)控優(yōu)勢(shì)。

臨床常用中藥黃芩始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有清熱燥濕、瀉火解毒和利尿等功效［7］，常與黃連作為藥對(duì)進(jìn)行用藥，臨床研究表明，黃芩治療2型糖尿病效果顯著［8-9］，具有降血糖和血脂等作用［10］。

上世紀(jì)人類基因組計(jì)劃測(cè)序工作完成以來，大規(guī)?；驕y(cè)序日益興起，產(chǎn)生了基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)等。后基因組學(xué)時(shí)代，基于新一代測(cè)序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)以高通量、高靈敏和易可視化等優(yōu)勢(shì)得到迅速應(yīng)用［10］。轉(zhuǎn)錄組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)方法之一，其整體性、系統(tǒng)性和綜合性與中藥多成分多靶點(diǎn)及整合調(diào)節(jié)的特點(diǎn)相符。目前關(guān)于黃芩防治肥胖的研究多集中在降脂降糖的臨床效應(yīng)上，對(duì)其差異基因的報(bào)道較少，特別是差異基因的通路上，更是鮮有報(bào)道。為了尋找黃芩降糖降脂防治肥胖引起的差異基因和其機(jī)制，本文運(yùn)用高脂飼料建立營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠模型，用黃芩湯藥灌胃進(jìn)行干預(yù)，使其血糖血脂得到改善。借助轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析方法，探討黃芩干預(yù)營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠的降糖降脂差異基因表達(dá)，為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥材的制備

藥材加入10倍量水浸泡1 h（浸透為準(zhǔn)），用武火開始加熱，沸騰后，改用文火（小功率）計(jì)時(shí)，40 min后，用紗布趁熱過濾藥液，在剩余的藥渣中繼續(xù)加8倍量水，按照上次煎煮工藝?yán)^續(xù)煎煮，合并兩次水煎液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到終濃度為1 g原生藥材/mL溶液，分裝，放于-20 ℃冰箱里保存待用。

1.2 造模與給藥

4周齡SD雄性大鼠24只，體質(zhì)量（90±10）g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供（SCXK〈湘〉2011-0003），飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心（SYXK〈贛〉2017-0004），適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為空白組8只、造模組16只，空白組給予含10%脂量的普通飼料喂養(yǎng)，模型白組給予含60%脂量的高脂飼料喂養(yǎng)，造模8周后，將模型組隨機(jī)分為模型組8只和黃芩藥物組8只，給藥劑量為0.1 g原生藥材/100 g大鼠體重，給藥5周后，大鼠空腹12 h，稱取體重，根據(jù)體重計(jì)算3%戊巴比妥鈉用量（50 mg/kg）進(jìn)行腹腔注射，在麻醉狀態(tài)抽取大鼠腹腔靜脈血，血液靜置2 h后3 000r/min離心10 min，取上層血清，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 表型測(cè)定

肥胖相關(guān)的體重和體長(zhǎng)每周采集一次，進(jìn)而計(jì)算 Lee’s指數(shù)，其公式為 Lee’s指數(shù) =［體重（g）］1/3×1 000/體長(zhǎng)（cm）。

同時(shí)，血液樣本每?jī)芍懿蓸右淮危凑障鄳?yīng)的血糖血脂檢測(cè)試劑盒上操作流程檢測(cè)，其檢測(cè)儀器為全自動(dòng)生化分析儀（Modular P800，瑞士羅氏）。

取肝臟約50 mg用Trizol法提取總RNA，質(zhì)檢合格后上BGISEQ-500平臺(tái)測(cè)序（深圳華大基因科技服務(wù)有限公司）。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 體重體長(zhǎng)和血糖血脂變化

造模8周后，與空白組比較，造模組SD大鼠腹部圓而肥胖，體重、體長(zhǎng)和Lee’s指數(shù)均明顯增加，血脂中的總膽固醇最先開始產(chǎn)生差異，發(fā)生在第2周，而甘油三酯和血糖發(fā)生在第4周，其他血脂指標(biāo)只有高密度脂蛋白膽固醇在第6周產(chǎn)生了差異，而給藥5周后，黃芩藥物組的體重和Lee’s指數(shù)并沒有得到逆轉(zhuǎn)，但是血糖水平顯著下降，高密度脂蛋白膽固醇顯著升高（P＜0.05），而總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平均有下降趨勢(shì)（P＞0.05）。見表1。

表1 高脂飼料喂養(yǎng)8周體征和血糖血脂變化（）

表1 高脂飼料喂養(yǎng)8周體征和血糖血脂變化（）

注：空白組8只，造模組16只。與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

GLU/（mmol·L-1）空白組 第2周 279.42±10.15 22.36±0.74 292.60±8.09 1.59±0.23 0.98±0.30 0.45±0.04 0.95±0.16 4.79±0.41造模組 第2周 315.40±18.08**22.69±0.52 299.91±6.39* 1.84±0.25* 1.24±0.46 0.55±0.26 1.04±0.33 5.27±0.90空白組 第4周 321.30±12.93 24.03±0.40 285.05±5.28 1.53±0.19 0.91±0.21 0.46±0.05 0.89±0.16 3.89±0.37造模組 第4周 381.16±29.26**24.55±0.44**295.17±8.04** 1.79±0.30* 1.48±0.54* 0.48±0.06 1.01±0.23 4.74±0.66**空白組 第6周 366.44±32.75 25.43±0.51 281.21±6.06 2.16±0.21 1.25±0.17 1.30±0.20 0.61±0.14 3.99±0.77造模組 第6周 413.08±32.04**25.61±0.55 290.63±5.89* 2.48±0.33* 1.46±0.42 1.64±0.29** 0.56±0.11 4.92±1.09*空白組 第8周 405.60±32.47 25.75±0.41 287.28±6.02 1.85±0.19 0.98±0.21 1.05±0.09 0.56±0.10 4.05±0.60造模組 第8周 453.21±35.38**26.28±0.59* 292.11±3.86** 3.08±0.27** 1.63±0.20* 1.72±0.16** 0.89±0.19 7.33±0.82**組別 周數(shù) 體重/g 體長(zhǎng)/cm Lee's指數(shù) TC/（mmol·L-1）TG/（mmol·L-1）HDL-C/（mmol·L-1）LDL-C/（mmol·L-1）

2.2 肝臟組織RNA-seq結(jié)果

聚類圖顯示，空白組和造模組以縱坐標(biāo)主成分有較好的分離，而黃芩藥物組基本處于二者之間。見圖1。相對(duì)于模型組，黃芩干預(yù)后，上調(diào)基因有23個(gè)，下調(diào)基因有15個(gè)（P＜0.05）。這些差異基因主要富集在生物節(jié)律和支鏈氨基酸合成代謝通路途徑中，黃芩藥物組Per1、Per3和Bhlhe40等生物節(jié)律相關(guān)基因上調(diào)，Sds等支鏈氨基酸合成代謝通路相關(guān)基因上調(diào)。見圖2和表2。

表2 給藥5周體征和血糖血脂變化（n=8）

圖1 肝臟組織差異基因聚類結(jié)果

圖2 肝臟組織差異基因結(jié)果

表3 黃芩對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠肝臟差異基因的影響

3 討論

已有很多研究團(tuán)隊(duì)開了肥胖的相關(guān)研究工作［12-13］，尤其是近些年來，借助多組學(xué)的技術(shù)優(yōu)勢(shì)［14-17］，在肥胖方面取得了較大的進(jìn)展［18-19］，然而臨床常用的苦寒藥在調(diào)控肥胖研究方面并未深入開展，尤其是基于新一代測(cè)序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)差異基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控方面鮮有報(bào)道。本文基于前期建立的營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠，以臨床常用苦寒藥黃芩進(jìn)行干預(yù)來初步探討其調(diào)控血糖血脂的作用。血清中的糖脂結(jié)果顯示黃芩具有降低血糖和總膽固醇的作用，且降糖的效果優(yōu)于降脂的效果，一定程度上體現(xiàn)了黃芩對(duì)糖脂的調(diào)控作用，與已有黃芩提取物對(duì)血糖血脂的影響相一致［20-21］。

為了更好了解黃芩對(duì)血糖血脂的調(diào)控機(jī)理，特別是哺乳動(dòng)物機(jī)體最大的實(shí)質(zhì)性代謝性器官肝臟中哪些基因參與了糖脂代謝過程?；谛乱淮鷾y(cè)序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)，課題組開展了肝臟組織表達(dá)譜測(cè)序，結(jié)果顯示差異基因主要位于生物節(jié)律和支鏈氨基酸合同通路中，這與中科院梁斌研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道的結(jié)果相符［3］。表明研究模型與人類肥胖和糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程相符合，且黃芩調(diào)節(jié)的作用靶點(diǎn)Sds基因，即絲氨酸脫水酶，在大鼠肝臟的活性受到飲食和激素等因素影響［22］。該基因富集于支鏈氨基酸合成通路，表明黃芩干預(yù)營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠后，調(diào)控支鏈氨基酸相關(guān)的酶和基因得到了加強(qiáng)。相對(duì)于模型組，黃芩藥物組還顯著上調(diào)了生物鐘相關(guān)的3個(gè)基因（Per1，Per3和Bhlhe40），表明黃芩可能通過延長(zhǎng)時(shí)間來轉(zhuǎn)化高脂飼料造成的能量過剩，進(jìn)而改善血糖和血脂。這一過程可能還涉及到了支鏈氨基酸合成代謝通路相關(guān)基因，但相關(guān)的候選基因作用機(jī)制還需進(jìn)一步驗(yàn)證和深入研究，本研究為黃芩及類似苦寒類藥物的機(jī)制研究提供了新的研究方案。