HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地山香圓葉中齊墩果酸和熊果酸的含量

★ 李瑤芳 劉明穎 鄧雙炳 王章偉 王振 黃冰峰 劉地發(fā)（1.創(chuàng)新天然藥物與中藥注射劑國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江西 贛州 341000；2. 江西青峰藥業(yè)有限公司 江西 贛州 341000）

山香圓葉為省沽油科植物山香圓Turpinia argutaSeem.的干燥葉，廣泛分布于江西、福建、湖南、廣東、海南、廣西、四川、貴州等地，夏、秋二季采收，味苦，性寒，歸肺、肝經(jīng)，具有清熱解毒、利咽消腫、活血止痛的功效，用于乳蛾喉痹、咽喉腫痛、瘡瘍腫毒、跌撲傷痛［1］，現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗炎［2］、抗菌、鎮(zhèn)痛［3］、免疫調(diào)節(jié)［4］、抗氧化等活性。山香圓葉中主要含有黃酮類、五環(huán)三萜類、有機(jī)酸類及甾醇類化合物，孫敬勇［5］通過分離提取得到山香圓葉中五環(huán)三萜化合物具有抗炎和清除自由基的活性?！吨袊幍洹?020年版中山香圓葉含量測(cè)定項(xiàng)為黃酮類成分女貞苷和野漆樹苷，另有文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于五環(huán)三萜類成分的測(cè)定方法是采用薄層色譜法和液相色譜法測(cè)定其熊果酸的含量［6］，未見同時(shí)測(cè)定齊墩果酸和熊果酸含量的報(bào)道，而齊墩果酸具有較強(qiáng)的抗菌作用［7］，為山香圓葉重要的抗炎活性成分之一。本文通過建立山香圓葉中齊墩果酸和熊果酸含量測(cè)定的方法，為山香圓葉及其制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

Agilent1260高效液相色譜儀（安捷倫公司）；百萬分之一天平（梅特勒-托利多科技有限公司，XPE26）；萬分之一天平（梅特勒-托利多科技有限公司，ML204T）；KQ-300DE超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

熊果酸對(duì)照品（批號(hào)：110742-201823，含量：99.30%），齊墩果酸對(duì)照品（批號(hào)：110709-201808，含量：91.10%）均購于中國食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用；甲醇、乙腈均為色譜純，乙醇、磷酸為分析純，水為超純水。不同產(chǎn)地山香圓葉樣品共30批，采自各產(chǎn)地，經(jīng)鑒定為Turpinia argutaSeem.的干燥葉。

表1 30批山香圓葉樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

分別取齊墩果酸對(duì)照品1.2 mg和熊果酸對(duì)照品2.5 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 供試品溶液的制備

取山香圓葉粉末（過三號(hào)篩）約1.0 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加入乙醇至近刻度，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）40 min，取出，放冷，再加乙醇至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱為ACE Excel 3 C18-AR（4.6 mm×150 mm，3 μm）；流動(dòng)相A為甲醇-乙腈（3∶1），B為0.2%磷酸溶液，梯度洗脫程序（0～33 min，80%A；33～38 min，80%～95%A ；38～40 min，95%～80%A ；40～50 min，80%A）；檢測(cè)波長為210 nm；柱溫為20 ℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣體積為20 μL。

2.4 專屬性

在“2.3”色譜條件下，分別精密吸取空白溶劑、對(duì)照品溶液及供試品溶液各20 μL注入液相色譜儀，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，空白溶劑無干擾，對(duì)照品溶液和供試品溶液中的齊墩果酸和熊果酸分離度良好，方法的專屬性良好。

圖1 各樣品HPLC色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察

精密稱取齊墩果酸2.5 mg、熊果酸4.8 mg，同置于100 mL量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，得到齊墩果酸和熊果酸的對(duì)照品貯備液。精密移取5，7.5，10，12.5，15 mL分別置于20 mL量瓶中，加乙醇稀釋至刻度。分別精密吸取20 μL注入液相色譜儀，在“2.3”條件下進(jìn)行測(cè)定，以進(jìn)樣濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。齊墩果酸、熊果酸的回歸方程分別為：Y=10.300X-0.598（r=0.999 9）和Y=9.283X-2.251（r=0.999 9），表明齊墩果酸、熊果酸分別在5.780 3～17.340 9 μg/mL和12.170 3～36.511 0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

按“2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液進(jìn)行重復(fù)性考察，分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各20 μL注入液相色譜儀，按“2.3”進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得齊墩果酸、熊果酸含量并計(jì)算其RSD，分別為1.3%和2.3%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.7 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取同一樣品約0.5 g，精密稱定，稱取9份，分別置25 mL量瓶中，分成3組，每組分別加入50%、100%、150%量的齊墩果酸和熊果酸對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)制備方法制備，測(cè)定齊墩果酸和熊果酸的含量。見表2。

表2 加樣回收結(jié)果

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24，48 h精密吸取20 μL注入液相色譜儀，在“2.3”條件下進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得齊墩果酸、熊果酸峰面積的RSD分別為3.0%和1.2%，結(jié)果表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 樣品含量測(cè)定

取不同產(chǎn)地的山香圓葉（過三號(hào)篩）樣品1.0 g，按“2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下，測(cè)量峰面積并用外標(biāo)法計(jì)算樣品中齊墩果酸與熊果酸的含量，樣品含量測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 30批山香圓葉齊墩果酸和熊果酸的含量測(cè)定結(jié)果 %

2.10 聚類分析

將30批山香圓葉樣品的齊墩果酸和熊果酸的含量，應(yīng)用SPSS 21.0軟件，采用組間連接法，以歐式平方距離為測(cè)度，Z值標(biāo)準(zhǔn)化后，對(duì)樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖2。從聚類結(jié)果可以看出，30批山香圓葉中熊果酸和齊墩果酸的含量差異較大，且與產(chǎn)地相關(guān)性較小，熊果酸的含量均相對(duì)高于齊墩果酸的含量，另熊果酸含量較高的批次，齊墩果酸的含量也較高，但二者的含量不成比例，其中重慶秀山梅江鎮(zhèn)20181210-9、江西安遠(yuǎn)20181204-5、江西于都20181204-6、貴州松桃太平鎮(zhèn)20181210-7，4批的齊墩果酸和熊果酸含量較高。30批山香圓葉中齊墩果酸的平均含量為0.035%，熊果酸的平均含量為0.058%。

圖2 30批山香圓葉齊墩果酸和熊果酸含量聚類分析樹狀圖

3 討論

3.1 提取方式考察

齊墩果酸和熊果酸為五環(huán)三萜類化合物，為同分異構(gòu)體，常常同時(shí)存在于藥材中。本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品提取過程進(jìn)行單因素考察，確定最佳提取條件：提取溶劑為乙醇、料液比1∶25、提取時(shí)間40 min、提取方式超聲提取。

3.2 流動(dòng)相體系的考察

本實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸溶液、甲醇-冰醋酸溶液、甲醇-甲酸溶液、甲醇-乙腈-磷酸溶液、甲醇-乙腈-甲酸溶液等流動(dòng)相，結(jié)果表明甲醇-0.2%磷酸（87∶13，V/V）溶液時(shí)，齊墩果酸、熊果酸和熊果酸右側(cè)色譜峰都能完全分離，但是隨著色譜柱柱效下降，熊果酸和熊果酸右側(cè)色譜峰分離度逐漸降低，無法完全分離，影響目標(biāo)成分積分，而在系統(tǒng)中添加一定量的乙腈可以大大增加熊果酸和熊果酸右側(cè)峰的分離度，因此最終選擇的流動(dòng)相體系為甲醇-乙腈（3∶1）-0.2%磷酸。

因?yàn)辇R墩果酸和熊果酸為三萜類化合物，僅有末端吸收，色譜柱中化合物的殘留影響基線，因此采用梯度洗脫，有機(jī)相上升至95%導(dǎo)致出現(xiàn)一個(gè)較大的梯度峰，可以使色譜柱洗脫較為完全，同時(shí)對(duì)目標(biāo)化合物的含量測(cè)定沒有影響。

3.3 色譜柱的選擇

色譜柱選擇ACE Excel 3 C18-AR（4.6 mm×150 mm，3 μm）色譜柱采用了特殊開發(fā)的配體，將C18鏈與完整苯基官能團(tuán)結(jié)合在一起，從而將C18和苯基特征的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合到單個(gè)相中，可以使齊墩果酸和熊果酸達(dá)到完全分離。柱溫為20 ℃、流速為1.0 mL/min，齊墩果酸和熊果酸可以完全分離，且基線較為平穩(wěn)。

3.4 耐用性考察

采用同一參數(shù)，流速（1.0±0.1）mL/min、柱溫（20±5）℃、波長（210±2）nm、流動(dòng)相（甲醇-乙腈 ＜3∶1＞）-0.2% 磷酸為（80±2）∶（20±2），磷酸（0.2±0.02）%、色譜柱（ACE Excel 3 C18-AR，4.6 mm×150 mm，3 μm）條件下測(cè)得含量的RSD（n=6）均在6.0%以內(nèi)，說明本方法的耐用性良好。其中色譜柱ACE Excel 3 C18-PFP（4.6 mm×150 mm，3 μm）無法將齊墩果酸和熊果酸分離，不適用于山香圓葉中熊果酸的含量測(cè)定。

3.5 方法準(zhǔn)確度

在上述色譜條件下測(cè)得山香圓葉中齊墩果酸和熊果酸的平均含量分別為0.035%和0.058%，齊墩果酸的回收率在96.82%～103.06%，RSD為2.3%，熊果酸的回收率在92.87%～100.61%，RSD為2.4%，符合《中國藥典》2020年版四部通則9101中待測(cè)成分含量0.1%，回收率限度90%～108%的要求。

綜上所述，本研究通過HPLC法，成功檢測(cè)了山香圓葉中齊墩果酸和熊果酸的含量。該方法簡單、靈敏度高、分離度好、回收率高，為山香圓葉及其制劑的質(zhì)量控制提供了檢測(cè)方法和參考依據(jù)。