清達(dá)顆粒對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)高血壓小鼠肝臟炎癥損傷的保護(hù)作用

熊曉滿，張 鈴，2，3，劉 菲，蔡巧燕，2，3，賈沛芝，陳達(dá)鑫，2，3，林 煒，2*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)陳可冀學(xué)術(shù)思想傳承工作室，福建福州 350122）

長(zhǎng)期血壓升高是導(dǎo)致心腦血管疾病的重要原因，會(huì)損害心、腦、腎等靶向器官，同時(shí)也會(huì)引起肝臟不同程度的炎癥及損傷［1-2］。清達(dá)顆粒（Qingda Granule，QDG）是由陳可冀院士臨床經(jīng)驗(yàn)方清眩降壓湯精簡(jiǎn)化裁而來(lái)，由天麻、鉤藤、黃芩及蓮子心組成，具有清肝熱、瀉心火、舒肝氣的功效［3］。前期課題組已經(jīng)證實(shí)QDG 具有較好的降壓及保護(hù)靶器官作用，同時(shí)能顯著抑制高血壓引起的心臟炎癥［4］及LPS 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)［5］。然而，QDG 對(duì)于高血壓引起的肝臟炎癥損傷方面作用未見報(bào)道，本研究通過(guò)構(gòu)建血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）誘導(dǎo)的高血壓小鼠模型，旨在探討QDG 對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓小鼠肝臟炎癥的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 18 只雄性SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠，8 周齡，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 QDG 由天麻、鉤藤、黃芩、蓮子心組成，藥品為顆粒劑，由江陰天江藥業(yè)有限公司制備（規(guī)格為每袋5 g，批號(hào)：1905310）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNFα）ELISA 試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司）；蘇木素染色液、伊紅染色液（北京索萊寶科技有限公司）；免疫組化試劑盒、DAB 染色液（邁新生物科技有限公司）。AngⅡ（英國(guó)Abcam 公司，貨號(hào)：ab120183）；小鼠含生長(zhǎng)因子樣模體黏液樣激素樣受體（mouse EGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 1，EMR1，又名F4/80，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：28463-1-AP）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 無(wú)創(chuàng)鼠尾血壓儀（美國(guó)Kent Scientific 公司）；生物組織石蠟包埋機(jī)（湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；石蠟切片機(jī)、生物顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；植入式膠囊滲壓泵（美國(guó)ALzet 公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模 在小鼠背部后正中線偏右側(cè)做一長(zhǎng)約1.5 cm 的縱行皮膚切口，分離皮下組織，將預(yù)裝好的微量泵以泵頭朝向小鼠尾部的方式埋入小鼠背部皮下，以500 ng/（kg·min）持續(xù)灌注AngⅡ溶液，連續(xù)灌注28 d。將皮膚切口創(chuàng)緣兩側(cè)對(duì)合后縫合，并消毒創(chuàng)口。將術(shù)后小鼠放于保溫毯并觀察其生命體征，待小鼠清醒后再放回鼠籠。

2.2 分組與干預(yù) 將C57BL/6 小鼠按1∶2 隨機(jī)分為對(duì)照組和造模組，造模組按“2.1”項(xiàng)建立高血壓模型，對(duì)照組運(yùn)用生理鹽水微量泵，余操作同“2.1”項(xiàng)。將造模成功的小鼠隨機(jī)分為模型組和給藥組，每組6 只。QDG 成人臨床給藥量為10 g/d，按照《中藥藥理研究方法學(xué)》中的劑量估計(jì)換算方法，給藥組按1.3 g/（kg·d）予QDG 藥液灌胃，對(duì)照組和模型組予同體積生理鹽水灌胃。于造模后第2 天開始給藥，連續(xù)灌胃28 d。

2.3 測(cè)量血壓 連接Kent 無(wú)創(chuàng)鼠尾血壓計(jì)，固定小鼠且置小鼠于保溫板上，鼠尾連接專用測(cè)量器，打開血壓測(cè)量軟件，血壓測(cè)量20 次循環(huán)（預(yù)循環(huán)5 次），造模前測(cè)量1 次基礎(chǔ)血壓后，每隔1 周測(cè)量1 次，連續(xù)測(cè)量4 周。記錄各組小鼠的收縮壓、舒張壓。

2.4 ELISA 法檢測(cè)血清ALT、AST、IL-6、TNF-α 表達(dá) 造模28 d 后分別取各組小鼠眼底靜脈血，靜置30 min后，于4 ℃、3 000 r/min下離心15 min，取上清。根據(jù)試劑盒操作步驟依次加入對(duì)應(yīng)試劑，最后每孔加入50 μL 終止液，15 min 后用酶標(biāo)儀于450 nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光度并記錄數(shù)值。

2.5 HE 染色法觀察肝組織病理形態(tài) 藥物干預(yù)28 d 后，取下各組小鼠的肝右葉于4%多聚甲醛中固定24 h，肝組織取4 cm×4 cm 大小置于70%酒精、80%酒精、90%酒精、無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ、石蠟Ⅲ脫水后包埋成石蠟塊。將肝組織石蠟塊切成4 mm，于37 ℃水中攤開置于載玻片上。60 ℃烤片2 h 后脫蠟，先伊紅染色，后蘇木素染核，晾干后用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍片。

2.6 免疫組化法檢測(cè)肝組織F4/80 表達(dá) 肝組織石蠟塊以4 mm 切片，60 ℃烤片2 h 后脫蠟，檸檬酸鈉法抗原修復(fù)，待恢復(fù)室溫后阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min，封閉液孵育1 h 后加入F4/80 一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜，二抗孵育1 h 后加入鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶孵育1 h，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，晾干封片后拍片觀察。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（xˉ±s）表示，采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 3 組小鼠收縮壓、舒張壓比較 造模后第0 天及第7 天3 組小鼠收縮壓及舒張壓差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對(duì)照組比較，模型組的收縮壓及舒張壓在造模后第14、21、28 天間均顯著升高（P＜0.05）。給藥組能顯著降低AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓小鼠的收縮壓及舒張壓（P＜0.05）。見表1。

表1 3 組小鼠造模后收縮壓、舒張壓比較（xˉ±s） mm Hg

3.2 3 組小鼠血清中AST、ALT 含量比較 與對(duì)照組比較，模型組血清AST 的表達(dá)及AST/ALT 比值均明顯升高（P＜0.05），經(jīng)QDG 給藥后AST 表達(dá)及AST/ALT 比值明顯降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 3 組小鼠血清中AST、ALT 含量比較

3.3 3 組小鼠血清中IL-6、TNF-α 含量比較 與對(duì)照組比較，模型組血清IL-6、TNF-α 的表達(dá)明顯升高（P＜0.05），經(jīng)QDG 給藥后IL-6、TNF-α 的表達(dá)明顯降低（P＜0.05），見圖2。

圖2 3 組小鼠血清中IL-6、TNF-α 含量比較

3.4 3 組小鼠肝臟組織病理形態(tài) 對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列整齊，而模型組肝組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，肝細(xì)胞排列稍紊亂，給藥組肝組織病理?yè)p傷較模型組明顯改善。見圖3。

圖3 3 組小鼠肝臟組織HE 染色圖（×40）

3.5 3 組小鼠肝臟組織F4/80 蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，模型組肝臟組織中F4/80 的表達(dá)明顯升高（P＜0.05），經(jīng)QDG 給藥后F4/80 表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。見圖4、圖5。

圖4 3 組肝臟組織F4/80 免疫組化圖（×40）

圖5 3 組小鼠肝臟組織F4/80 蛋白陽(yáng)性率比較

4 討 論

高血壓病不屬于中醫(yī)病名，根據(jù)其臨床癥狀，歸屬于“眩暈”范疇。其病位主要為心、肝、腎，病機(jī)為肝陽(yáng)上亢，治法為平肝潛陽(yáng)、鎮(zhèn)肝熄風(fēng)［6］。本研究中使用的QDG 由天麻、鉤藤、黃芩以及蓮子心組成，其核心思想是以風(fēng)眩論治，早治防變。君以天麻平肝熄風(fēng)，臣以鉤藤清熱平肝，佐以黃芩清肝瀉火，輔以蓮子心清心除煩，全方共奏清肝、平肝之效，主治肝陽(yáng)上亢證型高血壓病。藥理研究發(fā)現(xiàn)該方四味中藥及有效成分均具有抗炎作用［7-10］，這些都為QDG 防治高血壓及降低肝組織中的炎癥反應(yīng)提供了良好的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

現(xiàn)代研究表明，高血壓主要損害心血管系統(tǒng)，導(dǎo)致缺血性心臟病、中風(fēng)、癡呆、慢性腎臟病等疾?。?1］。雖然肝臟不是高血壓的靶向器官，高血壓導(dǎo)致肝臟疾病也未見報(bào)道，但在研究高血壓致病過(guò)程中發(fā)現(xiàn)高血壓對(duì)肝臟也存在影響。BRUIC 等［12］在自發(fā)性高血壓大鼠中發(fā)現(xiàn)肝臟有明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)及損傷。研究發(fā)現(xiàn)高血壓不僅與炎癥相關(guān)，其更是一種低級(jí)別的全身慢性炎癥疾?。?3］。除外心、腦、腎等炎癥反應(yīng)，BAL 等［14］發(fā)現(xiàn)DOCA-鹽高血壓大鼠肝臟中IκB-α 磷酸化水平升高，炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)顯著增加，表明高血壓的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中伴隨著肝臟炎癥反應(yīng)。另外，LIU 等［15］研究發(fā)現(xiàn)未治療的高血壓男性AST 越高，血壓越高，肝轉(zhuǎn)氨酶的水平與舒張壓呈正相關(guān)。也進(jìn)一步說(shuō)明肝臟損傷與血壓相關(guān)聯(lián)。而在本研究中，同樣發(fā)現(xiàn)在AngⅡ造模后小鼠的收縮壓及舒張壓均升高，血清中的AST 及AST/ALT 比值也顯著升高，且病理觀察也發(fā)現(xiàn)肝臟中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。F4/80 是一種細(xì)胞膜上的糖蛋白，是巨噬細(xì)胞特有的標(biāo)記物，該蛋白表達(dá)增加表明巨噬細(xì)胞活化，進(jìn)而引起下游炎癥因子表達(dá)。模型組小鼠血清中IL-6、TNF-α 表達(dá)量增加也佐證炎癥反應(yīng)的發(fā)生。而本研究也表明QDG能夠在降壓的同時(shí)，減輕肝組織中炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，減少巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物F4/80 的表達(dá)，降低血清中AST 表達(dá)及AST/ALT 比值。但QDG 有效降壓及抑制肝臟炎癥反應(yīng)的具體機(jī)制尚未闡明，可進(jìn)一步結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及測(cè)序等手段，富集QDG 中的有效活性成分及信號(hào)通路，全面探討QDG 的藥效作用機(jī)制。