蒲葵子乙醇提取物調(diào)控p21/CDK1/CyclinB1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞G2/M期阻滯的機制研究

林 薇，陳旭征，曹治云，鄭良樸，章尤權(quán)，趙錦燕*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建福州 350003）

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全世界每年約有84 萬例新發(fā)患者，癌癥致死率居全球第二，嚴(yán)重威脅人民健康和生命［1］。目前，作為常規(guī)治療方法的放化療毒副作用大，影響患者的生活質(zhì)量。因此，低毒、有效的天然抗腫瘤藥物成為了腫瘤治療的研究熱點。蒲葵子是棕櫚科蒲葵的種子，具有涼血止血、止痛和抗癌的作用，研究發(fā)現(xiàn)蒲葵子對肝損傷具有保護(hù)作用［2］。目前，國內(nèi)外已有關(guān)于蒲葵子抗肝癌活性成分的研究及抗腫瘤作用的報道［3-4］，課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，蒲葵子乙醇提取物（ethanol extract of Livistona chinensis seeds，EELC）能夠通過促進(jìn)線粒體凋亡途徑抑制肝癌生長（EELC 抑制約50%瘤體積和減少43%腫瘤重量）［5］，但蒲葵子抑制肝癌細(xì)胞增殖的機制研究尚未見報道。因此，本實驗擬以人肝癌HepG2 細(xì)胞和裸鼠皮下移植瘤為研究對象，研究EELC 抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用和分子機制。

1 實驗材料

1.1 實驗細(xì)胞和動物 人肝癌HepG2 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。20 只4～6 周齡雄性BALB/c裸鼠，體質(zhì)量18～20 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK（滬）2014-0005，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF 級實驗室。飼養(yǎng)實驗室內(nèi)溫度與濕度恒定，每天給予光照12 h，正常飲用水及飲食。

1.2 實驗試劑 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青-鏈霉素、胰蛋白酶（美國Gibco 公司）；MTT 粉末（北京索萊寶科技有限公司）；細(xì)胞周期試劑盒（南京凱基生物科技有限公司）；細(xì)胞周期蛋白B1（CyclinB1）、周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子p21（p21）、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。

1.3 實驗儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Flawil 公司）；酶標(biāo)儀（瑞士TECAN 公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）；石蠟切片機（德國Leica 公司）；生物組織自動脫水機和生物組織石蠟包埋機（湖北孝感醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；形態(tài)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)（美國Media Cybernetics 公司）。

2 實驗方法

2.1 EELC 的制備 參照文獻(xiàn)［5］制備方法，500 g蒲葵子加入5 000 mL 85%乙醇（體積比1∶10）回流提取后過濾，將濾液濃縮到相對濃度1.05 后噴霧干燥得到EELC 粉末，用HPLC-TOF/MS 進(jìn)行成分分析。EELC 粉末以DMSO 配置為500 mg/mL 儲存液用于細(xì)胞實驗，用時稀釋（DMSO 終濃度不超過0.5%）；以生理鹽水配置為300 mg/mL 灌胃液用于動物實驗。

2.2 細(xì)胞分組 將HepG2 細(xì)胞分為0、0.125、0.25、0.5 mg/mL 組，分別給予0、0.125、0.25、0.5 mg/mL濃度EELC 干預(yù)24 h。

2.3 MTT 法檢測細(xì)胞活力 將處于對數(shù)生長期的HepG2 細(xì)胞以1×105個/mL 的濃度接種于96 孔板中，每孔100 μL。細(xì)胞貼壁過夜后，按“2.2”項下分組干預(yù)24 h 后，每孔加入100 μL 0.5 mg/mL MTT 溶液孵育4 h，吸棄上清液，加入100 μL DMSO 溶解，充分震蕩后于酶標(biāo)儀570 nm 處檢測吸光度（A）值，并計算細(xì)胞活力（對照組100%）。

2.4 平板克隆形成實驗 按“2.2”項下分組干預(yù)24 h的HepG2細(xì)胞，以1 000個/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)7 d 后，多聚甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，計算克隆形成率（空白組100%）。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 按“2.2”項下分組干預(yù)24 h 的HepG2 細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，冰乙醇固定過夜后，按照試劑盒說明書用PI 染色后加入RNA 酶抑制劑，于流式細(xì)胞儀FL2 通道獲取10 000 個細(xì)胞，采用ModFit 軟件分析細(xì)胞G0/G1、S、G2/M 期的百分比。

2.6 皮下移植瘤模型建立及給藥 將處于對數(shù)生長期的HepG2 細(xì)胞和基質(zhì)膠以1∶1 比例混合均勻，以2×106個/mL 接種于裸鼠右腋皮下，待瘤體長至100～150 mm3，將裸鼠隨機分為對照組和EELC 組，每組10 只。EELC 組按3 g/（kg·d）予EELC 灌胃液灌胃，對照組以等體積生理鹽水灌胃，每日1 次，每周5 d，連續(xù)灌胃3 周。取材前8 h 禁食不禁水，戊巴比妥鈉麻醉后，頸椎脫臼處死，剝離腫瘤組織，取約1 cm3固定于4%多聚甲醛待測。

2.7 免疫組織化學(xué)法檢測小鼠腫瘤組織PCNA、CDK1、CyclinB1、p21 的蛋白表達(dá) 腫瘤組織包埋切片后，脫蠟進(jìn)行抗原修復(fù)，加入100 μL 內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育10 min，加入100 μL 非特異染色阻斷劑，室溫封閉30 min，滴加100 μL PCNA、Cyclin B1、CDK1、p21 一抗工作液（1：200），4 ℃孵育過夜，滴加100 μL 生物素標(biāo)記的羊抗小鼠/兔IgG，室溫孵育30 min，滴加適量的鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶室溫孵育10 min，滴加100 μL 新鮮配制的DAB 顯色液，光鏡觀察下控制顯色，顯色到棕黃色后置于蒸餾水中漂洗，終止顯色，蘇木素溶液中染色30 s，至細(xì)胞核呈淺藍(lán)色后，PBS 緩沖液返藍(lán)10 min，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡隨機拍取5 個視野，運用Motic 6.0 圖像分析系統(tǒng)對陽性率進(jìn)行半定量分析［6］。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行分析。計量資料符合正態(tài)分布以（xˉ±s）表示，2 組間比較采用獨立樣本t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；不符合正態(tài)采用非參數(shù)檢驗。

3 結(jié) 果

3.1 4 組HepG2 細(xì)胞活力比較 如圖1 所示，不同濃度（0.125、0.25、0.5 mg/mL）EELC 均可以顯著抑制HepG2 細(xì)胞活力（P＜0.05），呈劑量依賴。

圖1 4 組HepG2 細(xì)胞活力比較

3.2 4 組HepG2 細(xì)胞克隆形成情況比較 平板克隆形成實驗顯示，與0 mg/mL 組比較，不同濃度（0.125，0.25，0.5 mg/mL）EELC 均可 以顯 著抑 制HepG2 細(xì)胞克隆形成率（P＜0.05），呈劑量依賴，見圖2。

圖2 4 組HepG2 細(xì)胞克隆形成情況比較

3.3 4組HepG2細(xì)胞周期情況比較 如圖3所示，與0 mg/mL 組比較，不同濃度（0.125、0.25、0.5 mg/mL）EELC 均可以明顯抑制細(xì)胞周期進(jìn)程（P＜0.05），使其阻滯于G2/M 期，進(jìn)而抑制細(xì)胞分裂增殖。

3.4 2 組小鼠腫瘤組織PCNA 表達(dá) 如圖4 所示，與對照組比較，EELC 組明顯抑制小鼠肝癌組織PCNA 表達(dá)（P＜0.05）。

圖3 4 組HepG2 細(xì)胞周期情況比較

圖4 2 組小鼠腫瘤組織PCNA 表達(dá)（×400）

3.5 2 組 小 鼠 腫 瘤 組 織CDK1、CyclinB1 和p21 表達(dá) 如圖5 所示，與對照組比較，EELC 組明顯抑制小鼠肝癌組織CDK1 和CyclinB1 表達(dá)（P＜0.05），促進(jìn)p21 表達(dá)（P＜0.05）。

圖5 2 組小鼠腫瘤組織CDK1、CyclinB1 和p21 表達(dá)（×400）

4 討 論

肝癌是我國常見的消化道惡性腫瘤，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，一般將肝癌歸屬于中醫(yī)學(xué)“積聚”“癥瘕”“臌脹”“脅痛”等范疇。肝癌是病因病機極其復(fù)雜的全身性疾病，由于人體正氣虧虛，氣血陰陽失調(diào)，臟腑功能紊亂，機體產(chǎn)生的瘀血、痰濁、熱毒等病理產(chǎn)物相互搏結(jié)，蘊結(jié)于內(nèi)，遷延日久，積而成塊［7］。蒲葵子是棕櫚科植物蒲葵的種子，味苦、性寒，具有活血化瘀、軟堅散結(jié)的功效，臨床可用于肝癌等多種癌癥治療［2］。

細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖是惡性腫瘤發(fā)生的重要機制，本研究發(fā)現(xiàn)EELC 可以抑制肝癌HepG2 細(xì)胞的生長，阻滯細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖。為探討其可能作用機制，本研究構(gòu)建了裸鼠皮下移植瘤模型，檢測了調(diào)控細(xì)胞周期的相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。PCNA 是DNA 聚合酶δ 的輔助因子，在DNA 復(fù)制中發(fā)揮重要作用，是評價細(xì)胞增殖狀態(tài)的重要指標(biāo)，在腫瘤細(xì)胞中，PCNA 呈現(xiàn)過表達(dá)狀態(tài)［8］。本研究通過免疫組化檢測組織細(xì)胞中PCNA 蛋白水平發(fā)現(xiàn)，EELC 可下調(diào)PCNA 蛋白表達(dá)，提示EELC 可能通過抑制組織細(xì)胞中PCNA 表達(dá)來發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用。

細(xì)胞周期主要通過細(xì)胞周期蛋白、蛋白依賴激酶以及激酶抑制劑共同調(diào)控，細(xì)胞周期蛋白和蛋白激酶的異常表達(dá)會導(dǎo)致周期調(diào)控失常。細(xì)胞周期蛋白分為G1期、S期和M 期，CyclinB1是M 期周期蛋白，從S 期開始表達(dá)，在G2/M 期到達(dá)峰值，后期消失。CDK1 的活化依賴于CyclinB1，CyclinB1 與CDK1 結(jié)合，激活CDK1 可以促進(jìn)細(xì)胞由G2 期進(jìn)入M 期［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，EELC 干預(yù)會使細(xì)胞周期阻滯在G2/M 期，因此進(jìn)一步檢測EELC 對CyclinB1和CDK1 表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，EELC 明顯抑制了CyclinB1 和CDK1 的表達(dá)，說明EELC 調(diào)控G2/M期蛋白阻斷周期進(jìn)程，抑制肝癌細(xì)胞增殖。

p21 是細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑，能夠抑制CDK1/CyclinB1 的結(jié)合活化，阻滯細(xì)胞G2/M 期轉(zhuǎn)變［10］；p21 還可以和PCNA 的δ 亞基結(jié)合，抑制細(xì)胞增殖［11］。結(jié)果顯示，EELC 可以促進(jìn)p21 表達(dá)，證實EELC 促進(jìn)p21表達(dá)，阻斷細(xì)胞G2/M 進(jìn)程，抑制細(xì)胞增殖。

綜上所述，EELC 能夠明顯抑制肝癌HepG2 細(xì)胞以及皮下移植瘤的生長，對肝癌HepG2 的增殖具有抑制作用，其發(fā)揮抑制作用的機制可能是通過促進(jìn)p21 的表達(dá)，抑制PCNA、CDK1 和CyclinB1 的表達(dá)，阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程來實現(xiàn)的，研究結(jié)果將為EELC 在肝癌的臨床應(yīng)用提供有力的證據(jù)。目前研究發(fā)現(xiàn)，蒲葵子的有效化學(xué)成分包括黃酮類、酚類、皂苷類等，作為民間常用的治療肝癌的藥物，我們后期實驗將進(jìn)一步研究蒲葵子主要化學(xué)類成分的抗腫瘤活性，為臨床篩選低毒、高效的抗癌保肝藥物提供理論依據(jù)。