構(gòu)建電化學(xué)適配體生物傳感檢測(cè)薏苡仁和白扁豆中赭曲霉毒素A的研究

毛偉偉，胡奕津，黃麗珊，范 申，張紅艷

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州 350122）

近年來(lái)，真菌毒素對(duì)中藥的污染屢見(jiàn)報(bào)道，其中赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）因分布廣泛備受關(guān)注［1-2］。人們服用受毒素污染的中藥材或飲片攝入OTA，導(dǎo)致其在體內(nèi)蓄積，引發(fā)肝腎毒性、致癌性和致畸性等嚴(yán)重毒性作用［3］。常規(guī)的中藥炮制加工并不能完全去除OTA，而受OTA 污染的中藥材脫毒過(guò)程繁瑣且昂貴，可能造成活性成分喪失。因此，盡早檢出中藥材或飲片中可能存在的OTA污染，能夠及時(shí)對(duì)受污染的中藥進(jìn)行處置，是保障中藥質(zhì)量和用藥安全的一種經(jīng)濟(jì)有效的方法。

以核酸適配體（aptamer，Apt）為識(shí)別元件的電化學(xué)生物傳感器結(jié)合了適配體高特異性、高親和力與電化學(xué)方法簡(jiǎn)單便攜、響應(yīng)快、成本低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在高靈敏檢測(cè)OTA 方面具有廣闊的應(yīng)用前景［4］。材料科學(xué)的發(fā)展為高靈敏傳感策略的構(gòu)建提供了更多選擇。納米金（NG）具有優(yōu)良的生物相容性和導(dǎo)電性能，被廣泛用作電極修飾材料來(lái)提高電化學(xué)傳感性能［5］。還原氧化石墨烯（rGO）是一種創(chuàng)新的碳基材料，具有比表面積大、生物相容性好、穩(wěn)定性好、電催化活性高和導(dǎo)電性好等優(yōu)點(diǎn)［6］。與化學(xué)還原制備的rGO 相比，電化學(xué)還原氧化石墨烯（ErGO）具有均勻穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)環(huán)保、簡(jiǎn)單快速和易于控制等優(yōu)點(diǎn)［7］。研究表明，單鏈DNA（ssDNA）的堿基能夠與rGO 表面豐富的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生π-π堆疊作用而被吸附到rGO 表面［8］。該特性被廣泛用于構(gòu)建熒光和電化學(xué)適配體傳感方法，對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行快速定量檢測(cè)［9-10］。

基于上述研究基礎(chǔ)，本研究通過(guò)一步電沉積法制備ErGO-NG 涂層修飾的玻碳電極，吸附亞甲基藍(lán)（MB）標(biāo)記的OTA 特異性單鏈核酸適配體，構(gòu)建高靈敏、快速檢測(cè)OTA 的新方法，并將其應(yīng)用于中藥樣品中OTA 的檢測(cè)，以期為中藥材OTA 污染現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供新思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 CHI660E 電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）；CHB-202恒溫金屬?。ê贾莶┤湛萍加邢薰荆?；BSA224S 電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；5810R 臺(tái)式離心機(jī)、minispin plus 高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；ALPHA 1-2LD PLUS 凍干機(jī)（德國(guó)Marin Christ 公司）；SHP-250 生化培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；KQ-116 超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FE28 型pH 計(jì)（瑞士Mettler Toledo 公司）；Milli-Q Integra 超純水機(jī)（法國(guó)Merckmillipore 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與藥物 氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀和甲醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；石墨粉（上海麥克林生化科技有限公司）；四氯金酸三水合物（上海阿拉丁生化科技有限公司）；玻碳電極（武漢高仕睿聯(lián)科技有限公司）；銀/氯化銀參比電極和鉑絲對(duì)電極（上海辰華儀器有限公司）；OTA、黃曲霉毒素B1（AFB1）、嘔吐毒素（DON）和玉米赤霉烯酮（ZEN）標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）（北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司）；本實(shí)驗(yàn)中所有試劑均為分析純級(jí)別；所有水溶液均使用Millipore Milli-Q 系統(tǒng)純化的超純水（18.2 MΩ·cm）配制；中藥飲片薏苡仁和白扁豆均購(gòu)自福州本地藥店；本實(shí)驗(yàn)所用3'端標(biāo)記有MB 的OTA 適配體（Apt-MB）序列為：5'-GATCGGGTCTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-MB-3'，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并純化。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 氧化石墨烯（GO）的合成與表征 將0.5 g 石墨粉、0.5 g 硝酸鈉和23 mL 的濃硫酸置于圓底燒瓶中，于冰水浴中攪拌混勻，加入3 g KMnO4粉末，于35 ℃下持續(xù)攪拌約1 h，直到圓底燒瓶中形成濃稠的糊狀物。接著加入40 mL 超純水，同時(shí)迅速將溫度提高至90 ℃，繼續(xù)攪拌30 min。最后加入100 mL超純水與3 mL 的30%過(guò)氧化氫溶液，當(dāng)混合液的顏色由深棕色變?yōu)辄S色表示反應(yīng)終止。將混合液趁熱過(guò)濾，將濾餅攪拌分散在超純水中，隨后將濾餅分散液分裝在50 mL 的離心管中，1 000 r/min 低轉(zhuǎn)速離心3 min，多次重復(fù)操作直至完全去除大顆粒沉淀物。取上清液在8 000 r/min 下離心15 min，取沉淀物GO 重懸到超純水中，并用超聲處理以促進(jìn)GO 的分散。將上述制備的GO 分散液進(jìn)行冷凍干燥，最終得到干燥蓬松的黃色GO 粉末。將合成的GO 分散在水中，采用透射電子顯微鏡對(duì)其形貌進(jìn)行表征。

2.2 工作電極的制備 將玻碳電極（GCE）打磨拋光至光滑鏡面并對(duì)GCE 進(jìn)行活化，將活化后的GCE、銀/氯化銀參比電極和鉑絲對(duì)電極構(gòu)成的三電極體系浸入含有0.5 mg/mL GO 和2.5 mmol/L 氯金酸的混合溶液中，采用循環(huán)伏安法（CV）在+0.6～-1.6 V 電位范圍內(nèi)電沉積5 圈制備ErGO 和NG涂層修飾的GCE（ErGO-NG/GCE），用超純水清洗后干燥備用。

2.3 傳感器的構(gòu)建及OTA 的電化學(xué)檢測(cè) 將“2.2”項(xiàng)下制備的ErGO-NG/GCE 浸泡在含1 μmol/L Apt-MB 的PBS 緩沖液（10 mmol/L，pH 7.4）中孵育2 h，孵育后PBS 緩沖液清洗，低流速氮?dú)飧稍锛赐瓿蓚鞲衅鞯臉?gòu)建。將20 μL 不同濃度的OTA 標(biāo)準(zhǔn)品溶液滴加在電極表面，于20 ℃下反應(yīng)1 h，用PBS 緩沖液沖洗后將電極體系置于PBS 緩沖液中進(jìn)行差分脈沖伏安法（DPV）檢測(cè)。

2.4 方法的條件優(yōu)化 為使所建立的傳感方法具有最佳表現(xiàn)，在OTA 濃度為10 ng/mL 條件下，以達(dá)到最大峰電流差值ΔIp（ΔIp＝I－I0，其中I 和I0分別表示待測(cè)物加入后與前的峰電流值）為判斷依據(jù)，依次對(duì)Apt-MB 的濃度（0.5、0.8、1、1.5、2 μmol/L）、OTA 與Apt-MB 的反應(yīng)溫度（10～35 ℃）、反應(yīng)緩沖液的pH（6.0～8.5）和反應(yīng)時(shí)間（15～120 min）分別進(jìn)行了優(yōu)化。

2.5 方法的選擇性考察 在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下，將構(gòu)建好的傳感器分別與空白PBS 緩沖液、5 ng/mL OTA 標(biāo)準(zhǔn)品溶液、50 ng/mL 的其他真菌毒素（AFB1、ZEN 和DON）標(biāo)準(zhǔn)品溶液以及上述毒素混合物溶液（含5 ng/mL OTA 和50 ng/mL 的其他真菌毒素）孵育并用PBS 緩沖液沖洗后，將電極體系置于PBS 緩沖液中進(jìn)行DPV 檢測(cè)，每組平行測(cè)定3 次。

2.6 方法的重復(fù)性與再現(xiàn)性考察 在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下，使用同一批次的GCE 按照“2.2”“2.3”項(xiàng)構(gòu)建傳感器，與5 ng/mL 的OTA 孵育后采用DPV 平行測(cè)定6 次，并記錄峰電流變化考察方法的重復(fù)性；使用不同批次的GCE 同樣按照“2.2”“2.3”項(xiàng)構(gòu)建傳感器，與5 ng/mL 的OTA 孵育后采用DPV 平行測(cè)定6次，并記錄峰電流變化考察方法的再現(xiàn)性。

2.7 中藥樣品加標(biāo)回收率測(cè)定 分別將中藥飲片薏苡仁和白扁豆打粉過(guò)篩，稱取1.0 g 藥材細(xì)粉于50 mL 離心管中，加入適量OTA 標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻后加入10 mL 甲醇-水（7∶3）超聲提取30 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm 微孔濾膜后取續(xù)濾液，用PBS 緩沖液稀釋定容，制成低、中、高（0.1、1.0、10.0 ng/mL）3 種濃度的OTA 樣品溶液進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定，每種濃度平行測(cè)定3 次。

3 結(jié) 果

3.1 GO 與ErGO-NG/GCE 的形貌表征 從圖1A的透射電鏡圖可以看出本實(shí)驗(yàn)所合成的GO 在溶液中能夠被剝離分散成單片薄層，并呈現(xiàn)出卷曲、褶皺和邊緣折疊的GO 典型形貌特征，證明了GO 的成功制備；從圖1B 的掃描電鏡圖可以觀察到GCE電極表面電沉積的ErGO 具有更多的褶皺結(jié)構(gòu)，并且NG 能夠分散在ErGO 涂層中，表明一步電沉積法成功制備了ErGO-NG/GCE。

圖1 GO 與ErGO-NG/GCE 的形貌表征圖

3.2 傳感平臺(tái)構(gòu)建的電化學(xué)表征 在-0.2～+0.6 V電位范圍內(nèi)，采用CV 法以50 mV/s 的掃描速率在含0.1 mol/L KCl 和5.0 mmol/L［Fe（CN）6］4-/3-的PBS緩沖液中對(duì)不同修飾階段的電極進(jìn)行表征。如圖2 所示，裸GCE 具有一對(duì)大小相近的氧化還原峰（曲線a），當(dāng)在GCE 表面電沉積ErGO-NG 后，可以看到氧化還原峰電流均增大（曲線b），這是由于導(dǎo)電性良好的ErGO 和NG 改善了電極表面的電導(dǎo)率；當(dāng)Apt-MB 修飾到ErGO-NG/GCE 表面后，觀察到曲線c 的氧化還原峰電流大幅下降，并且峰間電位差增大，這是由于Apt-MB 的磷酸骨架帶負(fù)電荷，對(duì)同樣帶負(fù)電的電子具有排斥作用，此外大量Apt-MB 的吸附也增大了電極表面的空間位阻，最終導(dǎo)致電極表面電導(dǎo)率下降。上述結(jié)果表明各組分在GCE 表面的組裝是成功的，間接證明了所構(gòu)建的傳感平臺(tái)的可行性。

圖2 不同修飾電極的CV 圖

3.3 Apt-MB 濃度的優(yōu)化 從圖3 可以看出，ΔIp隨著Apt-MB 的濃度增大而增大，當(dāng)Apt-MB 濃度為1 μmol/L 時(shí)產(chǎn)生的ΔIp達(dá)到平臺(tái)值，即使繼續(xù)增大Apt-MB 濃度也沒(méi)有明顯增大，因此選擇1 μmol/L的Apt-MB 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 不同濃度Apt-MB 對(duì)峰電流差值的影響

3.4 OTA 反應(yīng)條件的優(yōu)化 從圖4A 可以看出，隨著反應(yīng)溫度的增大，ΔIp呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，因此選擇20 ℃作為最優(yōu)反應(yīng)溫度；從圖4B 可以看出，當(dāng)反應(yīng)緩沖液的pH 值為7.4 時(shí)，ΔIp達(dá)到最大值，因此選擇pH 7.4 的緩沖液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；從圖4C 可以看出，ΔIp隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而增大，并在反應(yīng)60 min 時(shí)達(dá)到平臺(tái)值，因此選擇60 min 作為后續(xù)OTA 與Apt-MB 的反應(yīng)時(shí)間。

圖4 OTA 與Apt-MB 的不同反應(yīng)條件對(duì)峰電流差值的影響

3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)不同濃度的OTA 進(jìn)行DPV 檢測(cè)，結(jié)果如圖5A 所示。在0～10 ng/mL 范圍內(nèi)，隨著OTA 濃度的增加，吸附在電極表面的Apt-MB 不斷與OTA 結(jié)合并脫離電極表面，導(dǎo)致MB 信號(hào)電流不斷減小。研究發(fā)現(xiàn)，在0.05～10 ng/mL 范圍內(nèi)，峰電流值Ip與OTA 濃度的對(duì)數(shù)（logCOTA）之間具有良好的線性關(guān)系，如圖5B所示，線性方程為：Ip＝1.446 9logCOTA－11.338 1，相關(guān)系數(shù)r＝0.993 8，檢測(cè)限（3 σ/S）為0.03 ng/mL。

3.6 方法的選擇性考察 在最優(yōu)條件下，用本方法分別 對(duì)5 ng/mL 的OTA 和50 ng/mL 的AFB1、ZEN和DON 進(jìn)行檢測(cè)。從圖6 可以看出，盡管非目標(biāo)毒素的濃度為OTA 的10 倍，但它們產(chǎn)生的ΔIp值都很小，而5 ng/mL 的OTA 則能夠產(chǎn)生明顯增大的ΔIp值。此外，毒素混合物溶液也會(huì)使ΔIp值明顯增大，并且產(chǎn)生的ΔIp值與單獨(dú)OTA 的ΔIp值基本一致，上述結(jié)果表明本方法對(duì)OTA 具有較強(qiáng)的選擇性，即本傳感器能夠有效對(duì)抗其他毒素成分對(duì)OTA 檢測(cè)的干擾。

圖5 OTA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖6 方法的選擇性考察

3.7 方法的重復(fù)性和再現(xiàn)性考察 在最優(yōu)條件下，分別使用同批次和不同批次的GCE 電極構(gòu)建傳感器對(duì)5 ng/mL 的OTA 平行測(cè)定6 次，并記錄峰電流變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，6 次重復(fù)性測(cè)定和再現(xiàn)性測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為2.11%和3.64%，表明本方法具有良好的重復(fù)性和再現(xiàn)性。

3.8 中藥實(shí)際樣品加標(biāo)回收率測(cè)定 選擇2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》中規(guī)定OTA 檢測(cè)的中藥薏苡仁和白扁豆進(jìn)行加標(biāo)回收測(cè)試。在經(jīng)HPLC及本方法皆未檢出OTA 的薏苡仁和白扁豆樣品中分別添加0.1、1、10 ng/mL 的OTA 標(biāo)準(zhǔn)品，加標(biāo)樣品采用本方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表1所示，本方法對(duì)2種中藥飲片樣品的加標(biāo)回收率為92.94%～105.17%，RSD≤5.60%，說(shuō)明該方法回收率和穩(wěn)定性良好，具有快速檢測(cè)中藥材OTA 污染的應(yīng)用前景。

4 討 論

目前常用的OTA 檢測(cè)方法包括基于色譜的檢測(cè)法（如高效液相色譜及其與質(zhì)譜的聯(lián)用法等）和免疫分析法（如酶聯(lián)免疫測(cè)定法和膠體金免疫層析法等）。前者靈敏度高、結(jié)果精確，但需要大型且昂貴的儀器與專業(yè)的檢測(cè)人員，無(wú)法滿足中藥材OTA現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求；后者快速高效、特異性強(qiáng)，但抗體存在制備過(guò)程復(fù)雜、穩(wěn)定性差、具有批次間差異等缺陷，限制了其廣泛應(yīng)用［11］。

表1 薏苡仁與白扁豆樣品中OTA 的加標(biāo)回收率測(cè)定（n＝3）

本研究基于ErGO-NG 材料和OTA 特異性適配體構(gòu)建了一種電化學(xué)傳感檢測(cè)方法用于OTA 的高靈敏檢測(cè)，見(jiàn)圖7。Apt-MB 通過(guò)π-π 堆疊作用吸附在ErGO-NG/GCE 表面，當(dāng)體系中不存在OTA時(shí)，電極表面吸附的MB 分子在一定電位下可產(chǎn)生較大的峰電流；當(dāng)體系中存在OTA 時(shí)，OTA 可與Apt-MB 結(jié)合形成穩(wěn)定復(fù)合物，使Apt-MB 的結(jié)構(gòu)發(fā)生卷曲，削弱了適配體與電極表面的π-π 堆疊作用，導(dǎo)致部分Apt-MB 遠(yuǎn)離電極表面，使吸附在電極表面的MB 減少，相應(yīng)的峰電流發(fā)生改變。據(jù)此可通過(guò)測(cè)量峰電流的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)OTA 的定量檢測(cè)。

圖7 OTA 電化學(xué)傳感檢測(cè)的原理圖

在最優(yōu)條件下，本方法的線性范圍為0.05～10 ng/mL，檢測(cè)限為0.03 ng/mL。這應(yīng)該歸功于通過(guò)一步電沉積法修飾在電極表面的ErGO-NG 材料具有良好的生物相容性和導(dǎo)電性能，提高了電極的導(dǎo)電能力，進(jìn)而大大提高了方法的靈敏度。將本方法應(yīng)用于中藥實(shí)際樣品薏苡仁和白扁豆中OTA 的測(cè)定，加標(biāo)回收率為92.94%～105.17%，RSD≤5.60%。該方法具有制作簡(jiǎn)單、操作方便、響應(yīng)速度快、檢測(cè)效率高、成本低廉和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。此外，本方法的選擇性強(qiáng)，即使在其他高濃度真菌毒素共存的情況下，也能實(shí)現(xiàn)對(duì)OTA 檢測(cè)，具有中藥材OTA 污染現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的應(yīng)用前景。

本方法具有潛在的通用性，可將識(shí)別元件更換為其他真菌毒素的適配體，可能實(shí)現(xiàn)對(duì)其他真菌毒素的快速檢測(cè)，有望為中藥材中真菌毒素的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供一種經(jīng)濟(jì)便利、高效靈敏的新思路。