食品中單核細胞增生李斯特氏菌 改良增菌液的研究

◎ 王 樂，陳 佳，秦 麗

（1.張家口市食品藥品檢驗中心，河北 張家口 075000；2.石家莊學院 化工學院，河北 石家莊 050035；3.河北省知識產權保護中心，河北 石家莊 050000）

單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes） 屬李斯特氏菌屬，革蘭氏陽性桿菌，是常見的食源性致病菌。該菌廣泛存在于自然界，很容易污染食品[1]。該菌具有嗜冷的特性，可在低氧條件和冷藏環(huán)境溫度下生長，能在加工廠和家庭冰箱內長時間存活[2]。單核細胞增生李斯特氏菌具有較強的致病性，是一種人畜共患病的病原菌，感染后可導致敗血癥、腦膜炎、孕婦流產等癥狀，對于免疫力低下人群感染后病死率可達20%～30%[3]。單核細胞增生李斯特氏菌已經被世界衛(wèi)生組織食品安全工作計劃列為重點監(jiān)測的食源性致病菌之一，也是我國食源性致病菌監(jiān)測網中的常規(guī)檢測項目[4]。各地進行的調查也顯示我國不同地區(qū)的食品存在不同程度的單核細胞增生李斯特氏菌污染情況。廣州市市售食品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢出率為1.45%[5]，大理州為2.99%[6]，寶雞市為8.49%[7]。該菌公共健康危害極為嚴重，在食品衛(wèi)生微生物檢驗中必須加以重視。

目前，對于食品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢測方法應用最廣泛的是依據《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》 （GB 4789.30—2016）的傳統培養(yǎng)方法和免疫金標法[8]、生物傳感器法[9]、核酸探針法[10]、聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）[11]、環(huán)介導等溫擴增檢測方法[12]以及可視化跨越式滾環(huán)等溫擴增[13]的快速檢測方法。這些檢驗方法都需要使用高選擇性的富集培養(yǎng)基來促進單核細胞增生李斯特氏菌在競爭背景菌群中的生長，以得到相對豐度較高的目標菌體。單核細胞增生李斯特氏菌雖然在自然界中廣泛存在，但食品中該菌一般含量較低，且受到加工損傷，不利于后續(xù)檢驗[14]。李氏增菌肉湯（LB1）為選擇性增菌液體培養(yǎng)基，含有萘啶酮酸，廣譜抗菌，尤其對革蘭氏陰性桿菌的抑制生長能力明顯[15]。但單純的選擇性富集培養(yǎng)基可能不利于損傷的單核細胞增生李斯特氏菌恢復。因此，對于受到非致死性損傷的單核細胞增生李斯特氏菌需要高營養(yǎng)的選擇性培養(yǎng)基進行恢復。

丙酮酸鈉有助于受損細胞的修復[16]。酵母浸膏中富含蛋白質、氨基酸類、肽類、核苷酸、B族維生素和微量元素，能夠補充氮源和提供微生物生長的多種維生素、氨基酸及生長因子[17]。本研究的目的是通過優(yōu)化富集培養(yǎng)基中的丙酮酸鈉和酵母浸膏含量，達到縮短檢測單核細胞增生李斯特氏菌時間的目的。這將在保證檢驗結果準確度的前提下使食品安全預警時間點前移，大大提高監(jiān)督工作效率和監(jiān)督力度，切實保障食品安全。

1 材料與方法

1.1 標準菌株

本研究中使用的單核細胞增生李斯特氏菌（CICC21583）購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 試劑與儀器

酵母浸膏，美國BD公司；磷酸鹽緩沖液、血瓊脂、李氏增菌肉湯（LB1）及平板計數瓊脂，北京路橋技術股份有限公司；丙酮酸鈉（99%），上海安譜實驗科技股份有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、2×PCR Master Mix，天根生化科技北京有限公司；引物及探針，生工生物工程上海股份有限公司。

二級生物安全柜，Synergy HTX；多功能酶標儀，Synergy HTX；恒溫培養(yǎng)箱，pHCbi；ME4002E電子天 平，梅特勒-托利多；3K15冷凍離心機，德國Sigma公司；LightCycler 480II實時熒光定量PCR儀，德國羅氏診斷有限公司。

1.3 菌懸液的制備

將-80 ℃保存的單核細胞增生李斯特氏菌CICC21583加入無菌磷酸鹽緩沖液中，挑取菌懸液劃線接種于血瓊脂平板上，36 ℃培養(yǎng)24 h。挑取單個典型菌落再次接種于血瓊脂平板上進行傳代。挑取活化好的單菌落接種于磷酸鹽緩沖液中，振蕩均勻，將菌懸液的麥氏濁度控制在0.5～0.6。對上述菌懸液進行10倍梯度稀釋，吸取3個連續(xù)梯度的100 μL菌懸液接種于平板計數瓊脂上，36 ℃培養(yǎng)48 h后計數。每個梯度做3個平行，取平均值。菌懸液的濃度為 1.5×107CFU·mL-1。

1.4 丙酮酸鈉添加量的優(yōu)化

為探究丙酮酸鈉添加量對單核細胞增生李斯特氏菌的增菌效果影響，以李氏增菌肉湯（LB1）為基礎，分別添加終濃度為0 g·L-1、1 g·L-1、2 g·L-1和3 g·L-1的丙酮酸鈉，分裝10 mL于滅菌后的試管中。將1 mL 1.3中適宜稀釋倍數的菌懸液接種至添加不同濃度丙酮酸鈉的李氏增菌肉湯（LB1）培養(yǎng)基?？瞻着囵B(yǎng)基作為對照，和接種后的培養(yǎng)基同時放入30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.5 酵母浸膏添加量的優(yōu)化

在得到最優(yōu)丙酮酸鈉添加量后，以添加一定含量丙酮酸鈉的李氏增菌肉湯（LB1）為基礎，分別添加終濃度為0 g·L-1、5 g·L-1、10 g·L-1、15 g·L-1和20 g·L-1的酵母浸膏，分裝10 mL于滅菌后的試管中。將1 mL 1.3中適宜稀釋倍數的菌懸液接種至添加不同濃度酵母浸膏的李氏增菌肉湯（LB1）培養(yǎng)基?？瞻着囵B(yǎng)基作為對照，和接種后的培養(yǎng)基同時放入30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.6 單核細胞增生李斯特氏菌OD550值的測定

培養(yǎng)2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h和24 h后，分別用酶標儀測量550 nm波長下空白培養(yǎng)基和菌懸液的OD550值。以OD550值的大小衡量單核細胞增生李斯特氏菌生物量的多少，得到丙酮酸鈉和酵母浸膏的最佳添加量。

1.7 單核細胞增生李斯特氏菌平板計數法的驗證

同時吸取1 mL菌懸液，10倍梯度稀釋后接種在平板計數瓊脂上，36 ℃培養(yǎng)48 h后計數。

1.8 實時熒光PCR法的特異性驗證

采用試劑盒法對培養(yǎng)一定時間后的改良李氏增菌肉湯（LB1）菌懸液進行DNA模板的提取，采用實時熒光PCR法驗證其特異性。試驗重復3次，設置陽性對照（單核細胞增生李斯特氏菌菌懸液基因組DNA），陰性對照（其他菌菌懸液基因組DNA）和空白對照（無菌水）。

實時熒光PCR檢測單核細胞增生李斯特氏菌所用引物和探針為：上游引物5’-CATGGCACCACCAGCATC-3’；下游引物5’-CATCCGCGTGTTTCTTTTCG-3’；探針5’ -FAM-CCGCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAECLIPCE-3’；內標探針5’-HEX-ATAGGAGCACTC GCCGCCCACATC-ECLIPCE-3’。最終反應體系為10×PCR緩沖液2 μL；dNTP Mixture（10 mmol·L-1） 1.6 μL；上下游引物各0.4 μL；探針0.6 μL；內標質粒探針0.6 μL；Taq DNA聚合酶0.4 μL；DNA模板 1 μL；去離子水補足20 μL。反應程序為：預變性95 ℃， 4 min；95 ℃，5 s；65 ℃，20 s；45個循環(huán)。

2 結果與分析

2.1 丙酮酸鈉添加量優(yōu)化結果

在李氏增菌肉湯（LB1）的基礎上添加丙酮酸鈉確實能夠提升對單核細胞增生李斯特氏菌的增菌效果，但這種積極影響只停留在添加量為1 g·L-1時。如圖1所示，當丙酮酸鈉的添加量繼續(xù)增加時，不但沒有促進單核細胞增生李斯特氏菌的增加，反而抑制了單核細胞增生李斯特氏菌的生長。當丙酮酸鈉添加量為1 g·L-1時，可以觀察到0～2 h的延遲期，這相比于未改良的李氏增菌肉湯（LB1）的4 h延遲期得到了縮短。在2 h之后，開始進入對數生長期，生長曲線的斜率明顯加大，直至20 h。20 h后單核細胞增生李斯特氏菌的生長進入靜止期。

2.2 酵母浸膏添加量優(yōu)化結果

在同一接種水平下，優(yōu)化增菌液成分后的單核細胞增生李斯特氏菌生長情況明顯好于未改良增菌液中的單核細胞增生李斯特氏菌。如圖2所示，在丙酮酸鈉添加量為1 g·L-1的基礎上優(yōu)化酵母浸膏的添加量，隨著酵母浸膏添加量的增大，增菌效果逐漸提升。添加量為20 g·L-1時增菌效果均優(yōu)于添加量為15 g·L-1，但增菌效果并未得到明顯提升。因此，在增菌效果與成本的綜合考慮下，酵母浸膏的最優(yōu)添加量為15 g·L-1。 最終改良增菌液的優(yōu)化結果為：在商品化李氏增菌肉湯（LB1）的基礎上，添加1 g·L-1的丙酮酸鈉，15 g·L-1的酵母浸膏。

2.3 平板計數測定的驗證結果

不同丙酮酸鈉和酵母浸膏添加量的李氏增菌肉湯（LB1）菌懸液平板計數測定結果與OD550值的變化趨勢基本相同，單核細胞增生李斯特氏菌的活菌數隨時間增加呈現上升的趨勢。未改良的李氏增菌肉湯（LB1）菌懸液中，0～4 h處于延遲期，4～20 h進入對數生長期，20 h后進入靜止期，24 h內未進入衰亡期。最終改良李氏增菌肉湯（LB1）菌懸液，0～2 h為延遲期，2～20 h為對數生長期，20 h后進入靜止期，24 h之前沒有出現衰亡期。不同培養(yǎng)時間下改良李氏增菌肉湯（LB1）菌懸液OD550值如表1所示。

表1 不同培養(yǎng)時間下改良李氏增菌肉湯（LB1）菌懸液OD550值表

2.4 培養(yǎng)時間優(yōu)化結果

在李氏增菌肉湯（LB1）的基礎上，添加1 g·L-1丙酮酸鈉時，培養(yǎng)16 h后即可達到未改良李氏增菌肉湯（LB1）培養(yǎng)24 h的菌懸液OD550值，培養(yǎng)時間縮短了8 h。在此基礎上，添加酵母浸膏進一步優(yōu)化增菌液成分，當培養(yǎng)時間為8 h時，就已經達到未改良增菌液培養(yǎng)24 h的效果，增菌時間縮短了2/3。

2.5 實時熒光PCR法的特異性驗證結果

將新鮮培養(yǎng)的單核細胞增生李斯特氏菌使用改良李氏增菌肉湯（LB1）培養(yǎng)8 h后，進行實時熒光PCR檢測。如圖3所示，添加1 g·L-1丙酮酸鈉、15 g·L-1酵母浸膏的改良李氏增菌肉湯（LB1）對食品中單核細胞增生李斯特氏菌特異性良好，可以實現食品中單核細胞增生李斯特氏菌的特異性增菌。

3 結論與討論

食品安全一直是事關民生的國家大事，也是各國普遍關注的焦點。其中，食源性致病菌更是食品安全問題的核心。因此，能夠更快速、準確地檢測出食品中的食源性致病菌就顯得至關重要。

本研究采用單因素實驗，發(fā)現在李氏增菌肉湯（LB1）中添加1 g·L-1的丙酮酸鈉和15 g·L-1的酵母浸膏能夠有效提高單核細胞增生李斯特氏菌的菌懸液濃度，縮短前增菌所需時間。應用改良后的前增菌培養(yǎng)液，在培養(yǎng)8 h后即可達到使用未改良前增菌培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h的效果，檢測時間大幅度縮短，即縮短了食源性致病菌的檢測周期，為食品安全監(jiān)管部門和重大食品安全事件預警提供了技術支撐。