羅紅霉素未知雜質(zhì)的分離鑒定與抗菌活性研究

孟祥燕 馮傳威 樊偉明 周煒祥 王建紅 劉小睿 沈永淼,*

(1 浙江震元制藥有限公司，紹興 312000；2 浙江理工大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系，浙江省高分子材料表界面科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310018)

紅霉素(erythromycin, EA)最初是由Lilly公司分離得到的首個(gè)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素藥物，是近半個(gè)世紀(jì)以來使用最廣泛的高效抗多數(shù)革蘭陽性菌和部分革蘭陰性菌的抗生素。主要由內(nèi)酯環(huán)、德糖胺和克拉定糖組成[1-2]。紅霉素在酸性條件下不穩(wěn)定，口服后易在胃酸作用下生成無抗菌活性的螺縮酮衍生物，生物利用率低[3]。為提高其穩(wěn)定性，人們對涉及反應(yīng)位點(diǎn)的C-6，C-9，C-11及C-12等進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，抑制環(huán)合降解，合成了一系列半合成的紅霉素衍生物。

紅霉素可分為紅霉素A、B、C、D、E、F，其中紅霉素E的制備僅在1973年的美國專利(US3714142)中有報(bào)導(dǎo)[4]。紅霉素ABCDE均有一定的抗菌活性，但活性差異較大，紅霉素A是紅霉素的主要活性成分。紅霉素B在抗菌譜和抗菌活性上與A相似，但毒性為A的兩倍；紅霉素C不是活性物質(zhì)，因此B和C除了在發(fā)酵中需控制含量，后續(xù)處理時(shí)也應(yīng)除去，以提高活性物質(zhì)A的含量。紅霉素E(圖1)由于含量低，相關(guān)研究較少，抗菌活性僅為A的13%[5]，一般作為非活性物質(zhì)除去[6-7]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，紅霉素E和羥胺反應(yīng)衍生化之后的產(chǎn)物—紅霉素E肟的抗菌活性也遠(yuǎn)不如紅霉素A肟[8]。羅紅霉素雜質(zhì)G'這個(gè)雜質(zhì)以往是由紅霉素E經(jīng)一系列反應(yīng)形成的(圖2)，均直接歸類到羅紅霉素的未知雜質(zhì)組分中，目前僅有一篇文獻(xiàn)通過質(zhì)譜推測了其可能的結(jié)構(gòu)[9]，沒有明確的雜質(zhì)研究及活性研究，以往均作為非活性物質(zhì)通過結(jié)晶工藝除去，國家標(biāo)準(zhǔn)中要求其含量＜0.5%，額外的純化工藝增加了羅紅霉素的成本。

本文通過制備液相色譜對羅紅霉素雜質(zhì)G'進(jìn)行有效分離提純，通過結(jié)構(gòu)表征確定了該雜質(zhì)為紅霉素E的衍生化產(chǎn)物，同時(shí)用前期確定結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)肟進(jìn)行進(jìn)一步衍生化反應(yīng)，同樣能得到羅紅霉素雜質(zhì)G'，進(jìn)一步佐證了結(jié)構(gòu)的正確性。抗菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該雜質(zhì)與羅紅霉素的抗菌活性相當(dāng)，說明羅紅霉素雜質(zhì)G'有成為新型抗菌藥物的潛力，同時(shí)，對羅紅霉素的生產(chǎn)工藝來說，如果經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)羅紅霉素雜質(zhì)G'的毒性與羅紅霉素相當(dāng)，在后續(xù)的生產(chǎn)中可降低羅紅霉素雜質(zhì)G'的質(zhì)控要求。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀(GTXH-3000；安捷倫科技有限公司)，色譜柱(C18，5 μm，4.6 mm×250 mm)，核磁共振譜儀(AVANCEⅢ-400M；瑞士布魯克拜厄斯賓有限公司)，質(zhì)譜儀(Thermo LCQ Fleet spectrometer；美國熱電公司)，硅膠(煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司)，二氯甲烷、氨水(薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司)，甲醇(杭州高晶精細(xì)化工有限公司)，9-(E)-紅霉素A肟粗品及羅紅霉素粗品均來自于浙江震元制藥有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 羅紅霉素雜質(zhì)G'的分離

2.1.1 從9-(E)-紅霉素A肟雜質(zhì)中分離

在前期的研究中已經(jīng)從9-(E)-紅霉素A肟的粗品中分離出9-(E)-紅霉素E肟[8]。本實(shí)驗(yàn)將已經(jīng)純化的3 g 9-(E)-紅霉素E肟粗品溶解在12 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶劑中，升溫至全溶，然后用冰水降溫度至10℃以下，加入0.8 mL甲醇鈉甲醇溶液，攪拌，繼續(xù)降溫，在恒壓滴液漏斗中，加入約10 mL DMF和1-甲氧基-2-氯甲氧基乙烷0.52 g，當(dāng)料液降溫至0℃以下，緩慢滴加，加完后攪拌，反應(yīng)結(jié)束后用醋酸調(diào)pH至6.5～7.5，將料液移至濃縮罐濃縮，控制內(nèi)溫小于65℃，至基本濃縮干后，加入3.0～5.0倍甲醇溶解，加入適量活性炭，保持溫度35℃～45℃脫色30 min以上，過濾，料液移至結(jié)晶罐中，用液堿調(diào)pH至10.5～11.5，再加入甲醇體積1.5～2.5倍的工藝用水進(jìn)行結(jié)晶，將固體離心甩干，真空干燥得產(chǎn)量為2.2 g，經(jīng)液相色譜及質(zhì)譜檢測，羅紅霉素雜質(zhì)G'的產(chǎn)率為70%。

2.1.2 從羅紅霉素中分離

取2.05 g羅紅霉素樣品溶解于適量CH2Cl2通過制備液相色譜進(jìn)行第一次分離，富集到純度為50%含量的羅紅霉素雜質(zhì)G'，然后再取500 mg 1次分離后的雜質(zhì)G'(50%左右含量)進(jìn)行2次分離，所用的制備層析條件如下：固定相：硅膠(200～300目，廠家：煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司)；洗脫劑：體積比CH2Cl2:CH3OH:NH4OH=50:1:1；檢測波長：210 nm；流速：30 mL/min。

2.2 羅紅霉素雜質(zhì)G'的結(jié)構(gòu)確證

2.2.1 由前體肟的結(jié)構(gòu)間接確證

在前期發(fā)表的文章[8]中已經(jīng)報(bào)道了中間體雜質(zhì)肟的結(jié)構(gòu)。從該雜質(zhì)肟出發(fā)，通過醚化反應(yīng)，得到了羅紅霉素雜質(zhì)G'，由此間接確證了雜質(zhì)G'的結(jié)構(gòu)。

2.2.2 譜圖表征直接確證

從羅紅霉素粗產(chǎn)品中直接分離所得到的雜質(zhì)G'，通過IR、1H-NMR、13C-NMR、HRMS、2D-NMR等表征手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。

2.3 抗菌活性研究

用微量稀釋法測定所分離的雜質(zhì)對革蘭陽性菌(金黃色葡萄球菌、肺炎球菌、草綠色鏈球菌以及白念珠菌)及革蘭陰性菌(大腸埃希菌)的最小抑菌濃度。本實(shí)驗(yàn)采用微量液體二倍稀釋法確定化合物對各種細(xì)菌的最小抑菌濃度(MIC)[10]。

3 分析與討論

3.1 雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析與鑒定

3.1.1 核磁共振波譜分析

將分離得到的羅紅霉素雜質(zhì)G'用CDCl3溶解，進(jìn)行核磁共振波譜分析，其1H-NMR和13C-NMR譜圖見圖3～4，數(shù)據(jù)及歸屬見表1～2。

表1 羅紅霉素G' 1H NMR數(shù)據(jù)及歸屬Tab.1 The 1H-NMR date and assignment of the roxithromycin impurity G'

表2 羅紅霉素G' 13C NMR數(shù)據(jù)及歸屬Tab.2 The 13C-NMR dateandassignment of theroxithromycin impurity G'

3.1.2 結(jié)構(gòu)鑒定

紅外吸收光譜在3433 cm-1：O-H伸縮振動(dòng)；1106 cm-1：C-O伸縮振動(dòng)；1106 cm-1：O-H面外彎曲振動(dòng)，1632、1592 cm-1：C=N伸縮振動(dòng)；2833 cm-1：-C-H伸縮振動(dòng)；1358 cm-1：C-H彎曲振動(dòng)。上述峰位顯示該雜質(zhì)中有-OH、C=N、飽和烷烴結(jié)構(gòu)，與羅紅霉素G' 結(jié)構(gòu)相符。同時(shí)，13C-NMR δ173.3 ppm的季碳峰也驗(yàn)證存在C=N；13C-NMR δ170.0 ppm的季碳峰表明存在脂羰基結(jié)構(gòu)。除此之外1H-NMR、13C-NMR峰的化學(xué)位移與結(jié)構(gòu)一致，表明與羅紅霉素G'分子結(jié)構(gòu)吻合。HRMS(ESI-TOF)m/z：[M+H]+計(jì)算C41H75N2O16的分子量為851.5117，譜圖測得分子量為851.5105，與 G'分子式相符，同時(shí)在紫外光譜近紫外區(qū)沒有強(qiáng)吸收峰，表明該分子結(jié)構(gòu)中無共軛體系。

該結(jié)構(gòu)中的2、3、4、5、6、8、10、11、12、13、28、39、30、34、35、36和38位是手性碳，其中2位碳?xì)浜?位碳?xì)浒l(fā)生偶合，偶合常數(shù)為10.7 Hz，推斷出2位H和3位H處于反式，都位于直立a健。其它手性碳構(gòu)型依據(jù)羅紅霉素G'反應(yīng)前體——羅紅霉素肟的單晶結(jié)構(gòu)推斷確定。從上述推斷可以得出羅紅霉素G'的結(jié)構(gòu)式(圖5)。

3.2 雜質(zhì)的抗菌活性研究

以羅紅霉素為參照物，對羅紅霉素雜質(zhì)G'進(jìn)行了抗菌活性研究，結(jié)果(表3)顯示，羅紅霉素雜質(zhì)G'的抗菌活性與羅紅霉素相當(dāng)，對肺炎球菌、草綠色鏈球菌的抗菌活性較好，對白念珠菌未顯示出抗菌作用，因此該雜質(zhì)有成為新型抗菌藥物的潛力。

表3 羅紅霉素雜質(zhì)G'的最低抑菌濃度Tab.3 The minimal inhibitory concentrations (MIC) of roxithromycin impurity G'

4 結(jié)論

本文通過液相色譜法來分離羅紅霉素中的一個(gè)主要未知雜質(zhì)羅紅霉素雜質(zhì)G'，然后通過1HNMR，13C-NMR、IR、HRMS等來確定未知雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)為紅霉素E衍生化產(chǎn)物，最后測試了該雜質(zhì)對金黃色葡萄球菌，肺炎球菌，大腸埃希菌，草綠色鏈球菌及白念珠菌的抗菌活性，與羅紅霉素比較發(fā)現(xiàn)兩者的抗菌活性相當(dāng)。因此，認(rèn)為通過對紅霉素E的結(jié)構(gòu)進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎椨型铣梢活愋滦涂咕幬?。且若兩者毒性和體內(nèi)抗菌活性也相當(dāng)，則在后續(xù)生產(chǎn)過程中可降低羅紅霉素G'的質(zhì)控要求，大大降低了生產(chǎn)成本。