殼聚糖/海藻酸鈉自修復(fù)水凝膠的制備與性能

耿志杰， 于珊， 曾志文， 黃駿， 國翠平， 魯?shù)罋g， 裴大婷

(1.廣東省科學(xué)院生物與醫(yī)學(xué)工程研究所， 廣東 廣州 510316； 2. 國家醫(yī)療保健器具工程技術(shù)研究中心， 廣東 廣州 510500)

水凝膠是由親水的單體或親水的聚合物分子鏈交聯(lián)形成的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，能夠吸水溶脹而不溶解，在生物醫(yī)用領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[1-4]。其中，天然高分子水凝膠具有親水性、良好的生物相容性和生物降解性等優(yōu)異性能，天然高分子水凝膠的研究日益受到人們的關(guān)注[5-7]。天然高分子水凝膠因與細(xì)胞外基質(zhì)極其相似的性質(zhì)和微環(huán)境，在藥物釋放、組織工程等方面的應(yīng)用潛力逐漸突顯[8-11]?；谔烊桓叻肿铀z在生物醫(yī)用領(lǐng)域顯著的應(yīng)用潛力，尋求一種簡單溫和可控的制備工藝構(gòu)筑水凝膠至關(guān)重要。

近年來，以殼聚糖(chitosan,CS)、海藻酸鹽等這些廉價易得的原料為代表的天然多糖凝膠獲得了較多關(guān)注。殼聚糖分子鏈上有大量的氨基和羥基等反應(yīng)活性基團，具有較好的生物相容性、抑菌性和生物降解性，殼聚糖的這些特性使其成為制備生物醫(yī)用材料的理想原料[12-15]。海藻酸鈉(sodium alginate, SA)是天然的線性高分子，因其良好的生物相容性、生物降解性、無毒性、低免疫原性等優(yōu)良性能被廣泛地應(yīng)用在生物醫(yī)用領(lǐng)域[16-20]。但由于海藻酸鈉分子鏈的羧基活潑性有限，常需要使用其他小分子試劑提高羧基活性，影響其生物相容性，從而影響其應(yīng)用，對海藻酸鈉進(jìn)行功能化改性是拓展海藻酸鈉應(yīng)用范圍的必然趨勢[21-22]。

本研究以自帶抑菌性能的殼聚糖和無毒的海藻酸鈉為原料，設(shè)計了一種溫和的反應(yīng)工藝獲得點擊交聯(lián)水凝膠。首先將海藻酸鈉氧化獲得醛基化的海藻酸鈉，使其具有更高的化學(xué)反應(yīng)活性，然后室溫條件下將CS和氧化海藻酸鈉(oxidized sodium alginate, OSA)溶液混合即得到快速交聯(lián)的水凝膠。該凝膠制備過程簡單，成膠時間可調(diào)，無須額外添加小分子交聯(lián)劑，提高了水凝膠的生物安全性。該自修復(fù)水凝膠具有良好的生物相容性、明顯的抑菌性能和促創(chuàng)面愈合效果，有望用于細(xì)胞培養(yǎng)、創(chuàng)面修復(fù)、藥物釋放、組織工程等領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

CS：分析純，脫乙酰度95%，黏度100～200 mPa·s，aladdin；SA：分析純，黏度(200±20) mPa·s，aladdin公司；高碘酸鈉(NaIO4)：分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠；冰乙酸、無水乙醇、乙二醇：分析純，麥克林試劑公司；小鼠胚胎成纖維細(xì)胞株(NIH-3T3)：中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；熒光素雙醋酸酯(FDA)：分析純，上海聯(lián)邁生物工程有限公司；CCK-8: APExBIO公司；無菌磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)：分析純，Gibco公司; 大鼠：SPF級，南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。

1.1.2 實驗儀器

電子天平：ME204E/02，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀：Nicolet IS10，美國賽默飛；冷凍干燥機：FD-1C-50，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；桌面型掃描電子顯微鏡：ProX，荷蘭飛納公司；旋轉(zhuǎn)流變儀：MCR302，奧地利Anton Paar；拉力試驗機：KJ-1065A，東莞市科建檢測儀器有限公司；酶標(biāo)儀：Spark，瑞士Tecan公司；CO2無菌培養(yǎng)箱：MCO-170AICUVL-PC，日本松下；倒置熒光顯微鏡：DMI8德國 Leica。

1.2 實驗方法

1.2.1 OSA的制備

稱取10 g SA分散于100 mL無水乙醇中磁力攪拌形成懸濁液，將與SA等物質(zhì)的量(9.89 g)的NaIO4加入100 mL純水中形成均勻的水溶液，然后將兩者混合室溫條件下避光反應(yīng)6 h后加入與NaIO4等物質(zhì)的量的乙二醇終止反應(yīng)0.5 h，然后將反應(yīng)混合液倒入大量的無水乙醇中沉析，棄上清液后將下層的沉淀物倒入透析袋(截留分子量3500)，去離子水中透析3 d，最后收集透析液冷凍干燥得到純化的 OSA。

1.2.2 CS-OSA點擊交聯(lián)水凝膠的制備

稱取1 g 的CS，將其溶于50 mL 1% 的冰乙酸溶液中，常溫下磁力攪拌配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的CS溶液，然后用NaOH調(diào)溶液的pH 值接近中性得到CS 溶液；稱取2 g OSA 溶于20 mL去離子水中，常溫下磁力攪拌配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的 OSA 溶液。將 CS 和 OSA 溶液分別以4∶1和2∶1的體積比快速充分混合均勻即得到 CS-OSA 水凝膠，分別記作Gel-1、Gel-2。

1.3 測試與表征

1.3.1 ATR-IR測試

對冷凍干燥的CS-OSA凝膠樣品，采用傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～500 cm-1測量范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。

1.3.2 SEM測試

對冷凍干燥的CS-OSA凝膠樣品的斷面噴金處理后，采用桌面型掃描電子顯微鏡在5 kV加速電壓條件下觀察樣品的表面形貌。

1.3.3 流變性測試

采用旋轉(zhuǎn)流變儀的震蕩模式，選用8 mm轉(zhuǎn)子(PP08)，振幅掃描在10 rad/s 的頻率下，應(yīng)變掃描范圍0.1%～100%，確定凝膠的線性粘彈區(qū)，在線性粘彈區(qū)，固定應(yīng)變1%， 頻率掃描范圍0.1%～100% 測定水凝膠的儲能模量(G′)和損耗模量(G″)。固定頻率為10 rad/s，連續(xù)交替進(jìn)行低應(yīng)變(1%)-高應(yīng)變(100%)掃描，4個循環(huán)震蕩振幅掃描測試。

1.3.4 拉伸性能測試

將凝膠切成長25 mm、寬10 mm、厚4 mm的長條形試樣(濕態(tài)凝膠)，采用拉力試驗機以2 mm/min的拉伸速率測試其拉伸性能。

1.3.5 溶脹度和體外降解測試

CS-OSA凝膠各個樣品冷凍干燥后稱取凝膠質(zhì)量m0，將各凝膠樣品浸泡在pH 7.4的緩沖溶液中，間隔一定時間取出凝膠用濾紙拭去表面多余的水分并稱重，直到凝膠質(zhì)量不再繼續(xù)增加認(rèn)為達(dá)溶脹平衡，稱取質(zhì)量ms。凝膠的平衡溶脹度=(ms-m0)/m0。凝膠達(dá)溶脹平衡后每隔1 d取出各凝膠樣品，用濾紙拭去表面多余的水分并稱重，質(zhì)量記作mt，用凝膠的質(zhì)量損失率表征凝膠的降解行為，凝膠的質(zhì)量損失率(%)=(ms-mt)/ms×100。

1.3.6 體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗

水凝膠與NIH 3T3細(xì)胞共培養(yǎng)，采用細(xì)胞計數(shù)kit-8(CCK-8)法，利用酶標(biāo)儀測吸光度[23]，評估凝膠材料的細(xì)胞毒性和細(xì)胞的存活率。在無菌的48孔板中制備凝膠樣品，用75%的酒精浸泡凝膠樣品消毒處理，然后用無菌PBS 緩沖液泡洗幾次徹底洗凈殘留的酒精。將500 μL(1×104個細(xì)胞)細(xì)胞懸液注入已處理好的凝膠樣品孔中作為測試組，500 μL(1×104個細(xì)胞)細(xì)胞懸液注入無凝膠的孔中作為對照組，500 μL 不含細(xì)胞的培養(yǎng)基注入無凝膠的孔中作為空白組。將培養(yǎng)板放在CO2無菌培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)中培養(yǎng)1、3、5 d，分別用含10% CCK-8的細(xì)胞培養(yǎng)基500 μL 注入各個孔中繼續(xù)孵育1 h，用酶標(biāo)儀在540 nm 測各個孔溶液的吸光度計算細(xì)胞的存活率，細(xì)胞存活率(%)=(D測試組-D空白組)/(D對照組-D空白組)×100，其中，D測試組、D對照組、D空白組分別為測試組、對照組、空白組的吸光度值。然后用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞經(jīng)熒光素二乙酸酯(fluorescein diacetate, FDA)活細(xì)胞染色劑染色后的形貌。

1.3.7 抑菌性能測試

抑菌實驗采用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，參考Zou等[24]的方法。實驗前將制備的水凝膠樣品紫外光照消毒處理，然后將等質(zhì)量的凝膠測試樣分別與大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在37 ℃ 培養(yǎng)箱共培養(yǎng)48 h作為測試組，未放置凝膠樣品的培養(yǎng)菌液同樣條件下培養(yǎng)48 h作為對照組，用酶標(biāo)儀測610 nm吸光度，計算細(xì)菌菌落數(shù)量，然后將測試組和對照組的菌液分別稀釋到合適的濃度，將其接種到瓊脂培養(yǎng)基平板上，37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h觀察測試組和對照組菌落的生長情況。

1.3.8 皮膚創(chuàng)面愈合測試

選用SPF級S-D雄性大鼠(每只重200～250 g)作為實驗對象，將大鼠麻醉，脊背兩側(cè)剃毛，用無菌手術(shù)剪在背中部脊柱兩側(cè)全層皮膚各剪一個10 mm 的圓形創(chuàng)面，止血處理后隨機分組備用。用水凝膠樣品覆蓋創(chuàng)面，3M壓敏膠包扎創(chuàng)面作為實驗組；對照組創(chuàng)面不作處理，用3M壓敏膠包扎創(chuàng)面。定期觀察實驗組和對照組大鼠創(chuàng)面的愈合情況。本實驗獲得廣東省質(zhì)量監(jiān)督醫(yī)療保健器具檢驗站倫理審查委員會的批準(zhǔn)(2021009)。

2 結(jié)果

2.1 CS-OSA水凝膠的紅外光譜圖

對比圖1中CS、OSA、Gel-1、Gel-2 譜圖可看出，CS 譜圖中在3 324 cm-1出現(xiàn)了N-H 和O-H 寬而強的伸縮振動吸收峰，1 597 cm-1處出現(xiàn)了N-H的彎曲振動吸收峰，OSA 譜圖中在1 608 cm-1出現(xiàn)了醛羰基的對稱振動吸收峰。而Gel-1、Gel-2譜圖中在3 324 cm-1和1 597 cm-1處消失了CS 上N-H 的特征峰，1 608 cm-1處消失了OSA 上醛羰基的特征峰，在1 553 cm-1處出現(xiàn)了新的吸收峰，這歸屬于-N=C 的伸縮振動，表明CS 上的氨基與OSA 上的醛基發(fā)生了席夫堿反應(yīng)，產(chǎn)生了亞胺鍵，說明CS-OSA 水凝膠的成功制備。

圖1 凝膠的紅外光譜圖

2.2 水凝膠的微觀形貌

在CS 和OSA 體系中，CS 上的氨基和OSA 上的醛基發(fā)生席夫堿反應(yīng)生成亞胺鍵形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，同時CS 分子和OSA 分子間也可能有氫鍵作用形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，亞胺鍵和氫鍵作用促使自交聯(lián)水凝膠快速形成。從圖2中可以看到，CS-OSA 水凝膠具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，圖2B較圖2A的網(wǎng)孔致密且網(wǎng)孔較大說明改變CS 和OSA 的比例可以調(diào)節(jié)CS-OSA 凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。交聯(lián)體系中增加OSA 的量使得交聯(lián)體系中醛基的量增多，CS-OSA 水凝膠的交聯(lián)點增多，從而水凝膠的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)更均勻致密。

A:Gel-1 凝膠的SEM圖；B:Gel-2 凝膠的SEM圖

2.3 CS-OSA水凝膠的形成機理及成膠效果

采用倒置小瓶法測試了CS-OSA 凝膠在室溫下的成膠時間，將CS 溶液與OSA 溶液分別以確定的體積混合，一定時間后倒置反應(yīng)瓶，如果混合液30 s 內(nèi)不流動則認(rèn)為樣品由溶液狀態(tài)轉(zhuǎn)成了凝膠狀態(tài)，此時的時間記為凝膠時間。測試結(jié)果表明CS 溶液與OSA 溶液混合后均能快速的形成凝膠，Gel-1 的成膠時間約8 s，Gel-2 的成膠時間約5 s，體系中OSA 增多,成膠時間縮短。這歸因于OSA 增多，體系中有更多的醛基與CS上的氨基發(fā)生反應(yīng)。圖3A展示了CS-OSA 水凝膠形成機理示意圖，圖3B展示了Gel-1 和 Gel-2 的成膠效果。

圖3 CS-OSA水凝膠的成膠機理示意圖A及成膠圖B

2.4 CS-OSA水凝膠的溶脹和體外降解性能

從圖4可見，Gel-1和Gel-2水凝膠在PBS中的溶脹度分別高達(dá)95和76，表明CS-OSA水凝膠具有明顯的吸水溶脹性能。凝膠內(nèi)部網(wǎng)絡(luò)的交聯(lián)結(jié)構(gòu)直接影響凝膠的溶脹行為，Gel-2較Gel-1凝膠內(nèi)部交聯(lián)密度大，則Gel-2凝膠的飽和溶脹度較低。隨著降解時間的延長，CS-OSA凝膠的質(zhì)量損失逐漸增大，降解初期Gel-1和Gel-2凝膠的質(zhì)量損失率相差不大，降解15 d后，降解曲線開始變緩，Gel-1凝膠較Gel-2凝膠降解多，質(zhì)量損失率分別達(dá)74%、61%，這表明凝膠的內(nèi)部交聯(lián)結(jié)構(gòu)對凝膠的降解有顯著的影響，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)交聯(lián)密度大的降解速度較慢，適當(dāng)提高凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的交聯(lián)密度可提高凝膠的穩(wěn)定性。

A:凝膠的平衡溶脹度；B:凝膠質(zhì)量損失率

2.5 CS-OSA水凝膠的流變性能和自修復(fù)性能

采用流變學(xué)測試評價了CS-OSA 水凝膠的流變性能。圖5A是振幅掃描，在低應(yīng)變范圍內(nèi)G′>G″，表明該階段是凝膠態(tài)，隨著應(yīng)變的增加G′明顯降低，G″明顯增大，當(dāng)G′G″，說明Gel-1 和Gel-2 均是穩(wěn)定的凝膠態(tài)，這也證實了CS 與OSA 溶液混合形成了穩(wěn)定的CS-OSA 水凝膠。在振幅掃描和頻率掃描中，Gel-2 凝膠的G′均高于Gel-1 的，這歸因于凝膠體系中提高OSA 的比例，體系中醛基的比例增多，形成的水凝膠交聯(lián)點增多，交聯(lián)密度增大，這與圖2 中凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)形貌結(jié)果一致。凝膠的交聯(lián)密度增大，隨之凝膠的強度增強，凝膠的G′也相應(yīng)增大。圖5C和圖5D分別是Gel-1 和Gel-2 凝膠的循環(huán)振幅掃描，在低應(yīng)變(1%)作用下，G′ >G″，表現(xiàn)出凝膠態(tài)，在高應(yīng)變(100%)作用下，G′明顯降低，G′

A: 振幅掃描； B: 頻率掃描； C: Gel-1凝膠循環(huán)震蕩振幅掃描； D: Gel-2凝膠循環(huán)震蕩振幅掃描； E: 凝膠的自修復(fù)效果圖

2.6 CS-OSA水凝膠的拉伸性能

CS-OSA凝膠體系中凝膠的網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)結(jié)構(gòu)可能是影響凝膠拉伸性能的主要因素，由圖2可知Gel-1 和Gel-2 的網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)密度不同，圖6顯示Gel-1 和Gel-2 的拉伸性能有差異。圖6A顯示Gel-1 和Gel-2 應(yīng)變均能達(dá)到30%以上不斷裂，斷裂時Gel-1較Gel-2 達(dá)到的應(yīng)變更大，而Gel-2 的拉伸應(yīng)力更大，隨著應(yīng)變的增加Gel-2 較Gel-1 的拉伸應(yīng)力增加的更快。圖6B顯示Gel-2 較Gel-1 的拉伸強度更高，Gel-2表現(xiàn)出更好的拉伸性能，這說明CS-OSA凝膠體系中醛基含量增多，凝膠的機械性能增強，這與圖2中Gel-2 有更均勻致密的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)結(jié)果相一致。CS-OSA凝膠具有一定的拉伸強度，這為CS-OSA凝膠在創(chuàng)面修復(fù)方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

A:拉伸應(yīng)力-應(yīng)變關(guān)系； B:拉伸強度

2.7 CS-OSA水凝膠的體外細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞毒性

圖7是NIH 3T3細(xì)胞在CS-OSA 水凝膠表面培養(yǎng)的增殖情況，Gel-1 和Gel-2 的凝膠培養(yǎng)的細(xì)胞存活率均在80% 以上(圖7A)，這說明CS-OSA 水凝膠沒有明顯的細(xì)胞毒性。隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞的存活率體現(xiàn)出上升趨勢，培養(yǎng)5 d時細(xì)胞的存活率已達(dá)到90% 以上，CS-OSA水凝膠表現(xiàn)出良好的生物相容性，一方面因為制備凝膠的原料是生物相容性好的多糖，另一方面因為成凝膠方式溫和，無須額外添加小分子交聯(lián)劑。為了進(jìn)一步驗證CS-OSA水凝膠良好的生物相容性，分別對在凝膠表面培養(yǎng)了1、3、5 d的細(xì)胞進(jìn)行活細(xì)胞染色后熒光顯微鏡下觀察的結(jié)果如圖7B，實驗組和對照組(陰性對照)的細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)沒有很明顯的差別，這與細(xì)胞存活率的結(jié)果一致，更有力的證實了CS-OSA 水凝膠無明顯的細(xì)胞毒性，具有良好的生物相容性，CS-OSA 水凝膠具有良好的生物醫(yī)用前景。

A:細(xì)胞存活率； B:熒光顯微鏡圖

2.8 CS-OSA水凝膠的抑菌性能

從圖8中可以看出，與對照組(陰性對照)相比，Gel-1 和Gel-2 水凝膠對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有明顯的抑制作用，且Gel-1 凝膠較Gel-2 凝膠表現(xiàn)出更強的抑菌效果，CS-OSA 水凝膠的抑菌性能很可能是CS 起主要作用，由于Gel-1 凝膠較Gel-2 凝膠中CS的占比大，抑菌效果更好。

圖8 CS-OSA水凝膠的抑菌性能

2.9 CS-OSA水凝膠的促創(chuàng)面愈合性能

圖9顯示在手術(shù)第5天時實驗組(Gel-1 和Gel-2)創(chuàng)面已明顯變小，而對照組創(chuàng)面愈合不太明顯，第10天時實驗組創(chuàng)面已基本愈合完全，對照組創(chuàng)面尚未完全愈合。實驗證明Gel-1 和Gel-2對皮膚創(chuàng)面均具有很好的促愈合效果。CS-OSA水凝膠具有很好的生物相容性和一定的抑菌效果，水凝膠含有大量的水分為皮膚創(chuàng)面提供良好的濕性愈合環(huán)境，為CS-OSA體系水凝膠在創(chuàng)面修復(fù)護理方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

圖9 CS-OSA水凝膠促創(chuàng)面愈合效果

3 討論

隨著濕性愈合理論的發(fā)展，水凝膠由于能夠吸水溶脹，具有很高的含水量使得其在創(chuàng)面愈合方面的應(yīng)用優(yōu)勢逐漸突顯。生物相容性良好的水凝膠應(yīng)用在創(chuàng)面愈合、護理，尤其是慢性創(chuàng)面的臨床治療、護理上，不僅可以提供濕性愈合的微環(huán)境，還能夠阻隔創(chuàng)面與外界的直接接觸，防止交叉感染，從而促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。

本研究以廉價易得的天然多糖CS和SA為原料，通過對SA改性獲得具有雙醛基結(jié)構(gòu)的OSA，利用席夫堿反應(yīng)制備點擊交聯(lián)水凝膠。通過控制CS和OSA的配比調(diào)節(jié)水凝膠的成膠時間和成膠性能。文中采用CS和OSA溶液以4∶1和2∶1的體積比分別制備凝膠Gel-1 和Gel-2并表征其性能，在溫和環(huán)保的實驗條件下無須額外添加小分子交聯(lián)劑即可快速成膠，最快可10 s內(nèi)成膠，凝膠具有良好的快速自修復(fù)性能。水凝膠的微觀形貌具有均勻的孔狀三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。體外細(xì)胞培養(yǎng)和抑菌性能測試證實該體系水凝膠不僅具有良好的生物相容性，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌還具有明顯的抑菌效果，動物創(chuàng)面模型實驗證明該體系凝膠能促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合。通過對比，Gel-1 和Gel-2凝膠性能各有優(yōu)缺，溶脹性、降解性和抑菌性能Gel-1 凝膠優(yōu)于Gel-2凝膠，而機械性能Gel-2凝膠表現(xiàn)更出色，后續(xù)可根據(jù)應(yīng)用場景選擇Gel-1 和Gel-2凝膠。CS-OSA水凝膠有望開發(fā)成抗菌支架或創(chuàng)面敷料等產(chǎn)品，為殼聚糖等多糖基水凝膠在生物醫(yī)用領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究設(shè)計的多糖體系的CS-OSA水凝膠制備方法簡單溫和，能夠快速成膠，具有良好的生物相容性、抑菌性能、自修復(fù)性能和適宜的力學(xué)強度。為了更好地應(yīng)用，可以進(jìn)一步研究該體系凝膠的滲液吸收能力、組織黏附性能和促進(jìn)細(xì)胞遷移能力，以及作為支架材料負(fù)載藥物或者生長因子等性能，為后續(xù)進(jìn)一步探索多糖體系水凝膠在生物醫(yī)用領(lǐng)域的應(yīng)用拓展提供依據(jù)，以期獲得更理想的功能性水凝膠敷料。

作者貢獻(xiàn)聲明

耿志杰：提出研究思路、設(shè)計實驗，實驗操作，統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，撰寫論文；于珊：實驗過程監(jiān)督，論文初審和修改；曾志文：論文修改和建議；黃駿：數(shù)據(jù)分析和建議；國翠平：數(shù)據(jù)分析和建議；魯?shù)罋g：文獻(xiàn)檢索、統(tǒng)計數(shù)據(jù);裴大婷：統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。