外源酶法降解發(fā)芽糙米中植酸的工藝研究

趙紅宇，景志剛，周盛華，關(guān)文鳳，王春柳

（1. 黑龍江康普生物科技有限公司，黑龍江哈爾濱 150025；2. 黑龍江省牛初乳工程技術(shù)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150025）

0 引言

糙米中含有蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、谷維素、維生素、谷固醇、碳水化合物及豐富的膳食纖維[1]。相較于經(jīng)打磨去掉米糠層及胚后的普通精米，糙米保留了絕大部分膳食纖維、維生素[2]。同時，發(fā)芽糙米有較好的醫(yī)療保健效果，對Ⅱ型糖尿病、老年癡呆、高血脂及癌癥有較好的預(yù)防作用。其市場開發(fā)潛力巨大，比糙米擁有更多營養(yǎng)成分，都是市售精米無法比擬的，由于糙米中存在抗?fàn)I養(yǎng)因子——植酸，抗?fàn)I養(yǎng)因子可以和人體體細(xì)胞表層的糖蛋白和低聚糖進(jìn)行結(jié)合，還可以與紅細(xì)胞發(fā)生凝結(jié)作用，抑制人體對糙米中營養(yǎng)成分的消化吸收，因此糙米并未體現(xiàn)出比普通精米更高的營養(yǎng)價值[3]。

目前發(fā)現(xiàn)，熱處理可以降低塊莖類食品中植酸的含量，但對谷類和豆類食品則沒有效果。Michal M等人[4]發(fā)現(xiàn)在食品加工過程中，植酸在長時間高溫下可能發(fā)生降解。Anuttam P[5]發(fā)現(xiàn)在147 ℃下烘烤15 min對于植酸含量可以起到顯著降低的作用（p=0.05），由此可見，熱處理具有降低植酸抗?fàn)I養(yǎng)作用，但其最終降低效果還有待進(jìn)一步研究及證實(shí)。植酸的化學(xué)降解也可以通過控制pH 值來實(shí)現(xiàn)，溶液pH 值在4.5～5.5 時，大豆中的植酸可以被降解，此時大豆蛋白的溶解度最低為35%～75%[6]。此外，隨著科技迅猛發(fā)展通過基因克隆生產(chǎn)出具有植酸酶的基因，利用重組表達(dá)技術(shù)將植酸酶基因轉(zhuǎn)移到植物中成為近年來的研究熱點(diǎn)[7]。

外源酶制劑的引入不僅可以補(bǔ)充和維持動物體內(nèi)的酶活性，還可以保障營養(yǎng)的利用率，并且能夠滅活食物中的部分抗?fàn)I養(yǎng)因子[8]。對于弘揚(yáng)中國傳統(tǒng)飲食文化、建立和諧的飲食結(jié)構(gòu)、開發(fā)環(huán)境友好型食品資源具有重要意義。同時，也可以為糙米及其制品的科學(xué)消費(fèi)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

次氯酸鈉（NaClO），山東力昂新材料科技有限公司提供；蒸餾水（H2O）、植酸（C6H18O24P6），南京都萊生物技術(shù)有限公司提供；氯化鐵（FeCl3）、磺基水楊酸（C7H6O6S）、氯化氫（HCl）、硫酸鈉（Na2SO4）、氫氧化鈉（NaOH）、冰乙酸、纖維素酶（U）、果膠酶（U）。

JA1003 型電子分析天平，廣西順德電器有限公司產(chǎn)品；LC-LX-HL210D 型臺式高速離心機(jī)，山東億偉安化工科技有限公司產(chǎn)品；DHG-9203A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海偉安化學(xué)試劑器械廠產(chǎn)品；1 000 μL 微量可調(diào)移液器，上海雷磁有限公司產(chǎn)品；HH-2 型恒溫水浴鍋，上海力辰儀器科技有限公司產(chǎn)品；PHS-25 型pH 計，山東億偉安化工科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

取8 支試管，分別加入質(zhì)量濃度為0.1 g/L 的植酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL，加蒸餾水至3 mL，再加0.03% FeCl3·6H2O 0.3%磺基水楊酸1 mL，搖勻待測。蒸餾水調(diào)零，于波長500 nm處測吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)溶液中的植酸含量（μg/3mL）為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

根據(jù)公式：

式中：X——樣品中植酸的含量，g/100 g。

1.2.2 不同酶解溫度對發(fā)芽糙米的植酸含量影響

選取發(fā)芽糙米2 g 用粉碎機(jī)打成粉末狀進(jìn)行試驗(yàn)，酶解時間60 min，溶液pH 值為4，酶用量5 mL，分別控制酶解溫度為27，37，47，57，67 ℃，以發(fā)芽糙米植酸含量為考查指標(biāo)。

1.2.3 不同酶解時間對發(fā)芽糙米的植酸含量影響

選取發(fā)芽糙米2 g 用粉碎機(jī)打成粉末狀進(jìn)行試驗(yàn)，酶解溫度47 ℃，溶液pH 值為4，酶用量5 mL，確定酶解時間為15，30，60，90，120 min，采用發(fā)芽糙米植酸含量為考查指標(biāo)。

1.2.4 不同pH 值對發(fā)芽糙米的植酸含量影響

選取發(fā)芽糙米2 g 用粉碎機(jī)打成粉末狀進(jìn)行試驗(yàn)，酶解溫度47 ℃，酶解時間60 min，酶用量5 mL，分別控制溶液pH 值為2，3，4，5，6，以發(fā)芽糙米植酸含量為考查指標(biāo)。

1.2.5 不同加酶量對發(fā)芽糙米中植酸含量的影響

選取發(fā)芽糙米2 g 用粉碎機(jī)打成粉末狀進(jìn)行試驗(yàn)，酶解溫度47 ℃，酶解時間60 min，溶液pH 值為4，纖維素酶與果膠酶按體積比1∶1 進(jìn)行配置分別控制酶用量為1，2，5，10，15 mL，以發(fā)芽糙米植酸含量為考查指標(biāo)。

1.2.6 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計

采用Box-behnken 試驗(yàn)原理，單因素試驗(yàn)情況為依據(jù)，選出對發(fā)芽糙米植酸含量顯著的3 個影響因素包括酶解溫度（A）、溶液pH 值（B）、酶用量（C） 進(jìn)行17 個試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)。

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計

1.2.7 樣品中植酸的提取

取樣品0.75 g，加入1.2%HCl 10%Na2SO4溶液30 mL，室溫下攪拌2 h，以轉(zhuǎn)速4 500 r/min 離心30 min，得到上清液，于4 ℃冰箱中保存。

1.2.8 樣品中植酸的測定

取上清液5 mL、15%三氯乙酸（TCA） 5 mL 于離心管中，混勻，4 ℃冰箱中靜置2 h，然后以轉(zhuǎn)速4 500 r/min 離心30 min。取上清液5 mL，用0.75%NaOH 調(diào)節(jié)其pH 值至6.2 左右，加水至75 mL，混和均勻，取3 mL 稀釋液，加入0.03%FeCl3·6H2O 0.3%磺基水楊酸1 mL，混勻后于波長500 nm 處比色測定。其計算方法同1.2.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

植酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 植酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同酶解溫度對發(fā)芽糙米植酸含量的影響

不同酶解溫度對發(fā)芽糙米植酸含量的影響見圖2。

由圖2 可知，隨著酶解溫度的升高，發(fā)芽糙米的植酸含量呈先降低后趨于平穩(wěn)波動性變化，在47 ℃左右發(fā)芽糙米中植酸含量存在最小值，其次溫度的繼續(xù)升高，植酸含量接近于平穩(wěn)有小幅增加。主要原因是由于反應(yīng)進(jìn)行，溫度逐漸上升，超過纖維素酶和果膠酶的最適溫度，對復(fù)合酶的抑制作用增強(qiáng)，即不能完全酶解發(fā)芽糙米中的植酸。綜合考慮，酶解溫度在47 ℃為宜。

圖2 不同酶解溫度對發(fā)芽糙米植酸含量的影響

2.3 不同pH 值對發(fā)芽糙米植酸含量的影響

不同pH 值對發(fā)芽糙米植酸含量的影響見圖3。

圖3 不同pH 值對發(fā)芽糙米植酸含量的影響

酶解pH 值為2～3 時，植酸含量有所下降。隨著pH 值逐漸增加，酶解率也逐漸提升，植酸含量逐漸減少。所以最適pH 值應(yīng)該在5 左右，此時其生長環(huán)境為偏酸性，出現(xiàn)植酸含量的最低值。pH 值過低或過高都不利于復(fù)合酶酶解反應(yīng)的進(jìn)行，阻礙酶促反應(yīng)速率。因此，利用復(fù)合酶進(jìn)行反應(yīng)時應(yīng)注重pH 值的調(diào)節(jié)。綜合考慮，pH 值在5 為宜。

2.4 不同酶用量對發(fā)芽糙米植酸含量的影響

不同酶用量對發(fā)芽糙米植酸含量的影響見圖4。

圖4 不同酶用量對發(fā)芽糙米植酸含量的影響

由圖4 可知，隨著酶用量增加，植酸含量逐漸降低。但當(dāng)酶用量為5 mL 左右時，植酸含量逐漸呈現(xiàn)平緩趨勢，不再下降。為不浪費(fèi)酶液的使用，有利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行，當(dāng)復(fù)合酶用量為5 mL時，植酸含量達(dá)到最低。隨著加酶量的增多，發(fā)芽糙米中植酸含量略有浮動，之后植酸含量基本為持平狀態(tài)。略有小幅度上升趨勢，不再呈現(xiàn)下降趨勢。綜合考慮，加酶量在5 mL 為宜。

2.5 不同酶解時間對發(fā)芽糙米植酸含量的影響

不同酶解時間對發(fā)芽糙米植酸含量的影響見圖5。

圖5 不同酶解時間對發(fā)芽糙米植酸含量的影響

酶解時間也會進(jìn)一步影響到發(fā)芽糙米中植酸的含量。酶解時間延長，發(fā)芽糙米中植酸含量逐漸呈現(xiàn)下降趨勢，但當(dāng)酶解時間在60 min 左右時，出現(xiàn)一個植酸含量的最低值。說明此酶解時間適合復(fù)合酶的酶解反應(yīng)，可有效促進(jìn)發(fā)芽糙米中植酸的分解。隨著時間的持續(xù)增長植酸含量不再出現(xiàn)變化。時間過長對植酸分解反應(yīng)試驗(yàn)并未起到促進(jìn)作用，反之時間過短則使復(fù)合酶分解植酸的反應(yīng)進(jìn)行不完全，因此時間過長或過短都不利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行。綜合考慮，酶解反應(yīng)最適時間約為60 min。

2.6 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)各因素對發(fā)芽糙米中植酸含量影響的重要程度，選取對植酸含量影響較高的3 個重要因素酶解溫度、pH 值及酶用量進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，在酶解溫度為47 ℃，pH 值為5，酶用量為5 mL 條件的左右位置兩側(cè)，設(shè)置一個對比試驗(yàn)點(diǎn)，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)操作，其中控制酶解時間為60 min 不變。采用Box-behnken 設(shè)計對外源酶降解發(fā)芽糙米中植酸的條件進(jìn)行優(yōu)化。

響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

2.6.1 響應(yīng)面分析數(shù)學(xué)模型的建立

針對表2 中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，在對其響應(yīng)面進(jìn)行回歸分析時，可以發(fā)揮Design Expert 8.0[9]軟件優(yōu)勢，得到試驗(yàn)的回歸模型方程為：

回歸及方差分析見表3。

2.6.2 各因素影響程度分析

由表3 可知，二次回歸模型的方差分析該模型，失擬項(xiàng)p=0.103 5＞0.05，說明模型預(yù)測值與實(shí)際誤差值較小，模型的擬合程度良好，未知因素對試驗(yàn)結(jié)果干擾很小。3 個因素的p 值均＜0.01，表明酶解溫度、pH 值及酶用量均是影響外源酶降解發(fā)芽糙米中植酸含量的重要因素[9]。判斷這些因素同試驗(yàn)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)程度[10]，以其本身所有的F值為依據(jù)，數(shù)據(jù)結(jié)果越大，則表明對試驗(yàn)指標(biāo)的影響越大。從方差分析結(jié)果可知，F(xiàn)（A）=9.21，F(xiàn)（B）=0.56，F(xiàn)（C）=11.25，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，對響應(yīng)值的影響排序?yàn)镃＞A＞B，進(jìn)一步證明該回歸方程在分析外源酶對發(fā)芽糙米中植酸含量的影響具有一定的優(yōu)勢[11]。根據(jù)表2可知，在回歸方程中，交互項(xiàng)顯著的存在于其所具有的一次項(xiàng)A，B，C自變量參數(shù)，及二次項(xiàng)A2，B2，C2自變量參數(shù)當(dāng)中，從而說明外源酶降低發(fā)芽糙米中植酸含量會受到3種因素的顯著性影響，同時3種因素之間也呈現(xiàn)一定的交互特征。

表2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計方案及結(jié)果

2.6.3響應(yīng)面分析

響應(yīng)面分析利用Design Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，二次模型所得到的等高線及響應(yīng)曲面3D效果。

pH值和酶用量對發(fā)芽糙米中植酸含量影響的等高線和響應(yīng)曲面見圖6，酶用量和酶解溫度對發(fā)芽糙米中植酸含量影響的等高線和響應(yīng)曲面見圖7，酶解溫度和pH值對發(fā)芽糙米中植酸含量影響的等高線和響應(yīng)曲面見圖8。

圖6 pH值和酶用量對發(fā)芽糙米中植酸含量影響的等高線和響應(yīng)曲面

圖7 酶用量和酶解溫度對發(fā)芽糙米中植酸含量影響的等高線和響應(yīng)曲面

根據(jù)二次模型所得到的等高線及響應(yīng)曲面可以評價試驗(yàn)因素之間的交互作用強(qiáng)度，以及確定各因素的最佳水平范圍。在分析交互作用時，AC組的p值最小且小于0.01，說明AC對發(fā)芽糙米中植酸含量的降解發(fā)揮作用極顯著。

由圖6可知，當(dāng)酶用量不變時，隨著pH值的升高，曲線走勢較為平緩；當(dāng)pH值不變時，酶用量增加，發(fā)芽糙米中植酸含量先減少后增多，結(jié)合方差分析說明，酶用量和溫度交互作用較為顯著。由圖7可知，當(dāng)酶用量穩(wěn)定時，酶解溫度增加發(fā)芽糙米中植酸含量呈先減少后增多趨勢；當(dāng)酶解溫度穩(wěn)定不變時，隨酶用量增加，發(fā)芽糙米中植酸含量呈逐漸減少后增多的相同趨勢；結(jié)合方差分析結(jié)果，酶解溫度和酶用量間交互作用顯著。由圖8 可知，當(dāng)pH值不變時，隨酶解溫度升高，發(fā)芽糙米中植酸含量呈先減少后增多趨勢；當(dāng)酶解溫度不變時，pH 值增加，降解率緩緩增加，曲線很平緩，結(jié)合方差分析說明溫度和接種量交互作用不顯著。由各因素交互作用影響發(fā)芽糙米中植酸含量的等高線圖和曲面圖可知，當(dāng)各因素的值處于中等水平時，曲面中心區(qū)域的發(fā)芽糙米中植酸含量較少，并存在極低點(diǎn)。

圖8 酶解溫度和pH 值對發(fā)芽糙米中植酸含量影響的等高線和響應(yīng)曲面

借助Design Expert 8.0 軟件，為驗(yàn)證外源酶對發(fā)芽糙米中植酸含量影響的響應(yīng)模型的準(zhǔn)確性和可靠性，在最佳條件下，進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)驗(yàn)證?？紤]試驗(yàn)的實(shí)際情況，經(jīng)過對所得回歸方程取一階偏導(dǎo)等于0，得知A=45.57，B=4.90，C=6.05 為最佳組合，在此最優(yōu)組合中，理論植酸含量為0.259±0.22 g/100 g。接近預(yù)測的理論值，表明該數(shù)學(xué)模型對外源酶降解發(fā)芽糙米植酸含量的優(yōu)化工藝可行。綜合考慮理論數(shù)值和實(shí)際應(yīng)用性，外源酶降解發(fā)芽糙米植酸最佳條件為酶解溫度46 ℃，pH 值4.90，酶用量6.05 mL。

2.7 外源酶對發(fā)芽糙米植酸降解率結(jié)果

采用分光光度法測定酶解后發(fā)芽糙米中植酸含量。采用響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)最佳條件處理發(fā)芽糙米中植酸含量變化情況。

酶解后發(fā)芽糙米中植酸含量變化情況見表3。

由表3 計算出經(jīng)優(yōu)化植酸降解條件后，采用果膠酶和纖維素酶混合處理后糙米中植酸含量降解率為58.89%。

表3 酶解后發(fā)芽糙米中植酸含量變化情況/g·（100 g）-1

3 結(jié)論

采用分光光度法、單因素試驗(yàn)、響應(yīng)曲面法等方法，添加外源酶，并對外源酶降解植酸條件進(jìn)行優(yōu)化分析，得到主要結(jié)論如下：單因素試驗(yàn)結(jié)果外源酶降解發(fā)芽糙米中植酸的最佳條件為酶解溫度47 ℃，pH 值5，酶用量5 mL，酶解時間1 h。響應(yīng)面試驗(yàn)中確定3 個重要因素，經(jīng)Design Expert 8.0 軟件響應(yīng)面分析優(yōu)化，模型擬合性良好，外源酶降解發(fā)芽糙米中植酸含量的最理想降解條件為酶解溫度46 ℃，pH 值4.90，酶用量6.05 mL。在此條件下進(jìn)行試驗(yàn)，酶解時間1 h，此時發(fā)芽糙米中植酸含量酶解率最高，為58.89%。