黃酒中菌落總數(shù)測定不確定度評定

相露婷，傅華靖，王佳麗，劉 鎮(zhèn)

（紹興市食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江紹興 312000）

菌落總數(shù)是食品檢驗(yàn)較為常見的檢測項(xiàng)目。在實(shí)際檢測中，樣品中菌種總數(shù)的檢測結(jié)果往往發(fā)散較大，而影響檢測結(jié)果的因素也很復(fù)雜。因此，每個實(shí)驗(yàn)室都會對本實(shí)驗(yàn)室的菌落總數(shù)計(jì)數(shù)的能力進(jìn)行考核驗(yàn)證。黃酒作為地理標(biāo)志產(chǎn)品，其檢測過程中對菌落總數(shù)并沒有作出明確的規(guī)定，但微生物污染對于黃酒的生產(chǎn)和保存是非常關(guān)鍵的因素，在生產(chǎn)加工過程中對菌落總數(shù)的監(jiān)測是必不可少的項(xiàng)目。因此，對菌落總數(shù)的檢測不確定度評定是必不可少的。由于黃酒本身的特殊性質(zhì)，其中含有的乙醇可能對菌落產(chǎn)生一定的抑制作用，從而影響菌落計(jì)數(shù)結(jié)果，所以此次對黃酒中菌落計(jì)數(shù)的不確定度進(jìn)行評定非常重要且具有實(shí)際參考意義。

本次研究應(yīng)用平板菌落計(jì)數(shù)法測量黃酒中的菌落總數(shù)，通過對影響測量結(jié)果的不確定度分量的分析和量化，求出被測定菌落總數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度，并對測量結(jié)果進(jìn)行表述。鑒于檢測過程中黃酒本身含菌量較少，在實(shí)際實(shí)驗(yàn)樣品中加入少于100 CFU 標(biāo)準(zhǔn)菌株作為污染菌，以便統(tǒng)計(jì)和分析研究。因此，在測定不確定度之前，還需測定該黃酒對不同菌種的抑制情況，從中選擇影響較小的菌種進(jìn)行不確定度評定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本次研究采用樣品為市面上較為常見的傳統(tǒng)型黃酒，酒精度為11.0%vol，酒齡3 年。菌種為大腸埃希氏菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC6538、鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，生產(chǎn)廠家為青島海博，批號20190531；平板計(jì)數(shù)瓊脂，生產(chǎn)廠家為青島海博，批號20200504；氯化鈉，生產(chǎn)廠家為國藥化工，批號20191106。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ2000B 型電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；ESCO class Ⅱ型生物安全柜，新加坡藝思高科技有限公司；MLS-3780 型高壓蒸氣滅菌器，日本三洋公司；HPP260 型生化培養(yǎng)箱，德國memmert 公司；BGZ-240 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌液計(jì)數(shù)

取標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基36 ℃培養(yǎng)24 h，將菌液制成10 倍系列稀釋液，吸取1 mL 稀釋液，每個稀釋度做兩個平皿。同時，分別吸取1 mL 稀釋液加入2 個無菌平皿中，作為空白對照。使用平板計(jì)數(shù)（Plate Count Agar，PCA）培養(yǎng)基注皿。于36 ℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)。上述菌液2 ℃冰箱冷藏保存，以保證菌液濃度維持在此水平。

1.3.2 回收率測定

選取菌落數(shù)量在500 ～1 000 CFU/mL 稀釋度菌液，分別加入10 mL 黃酒中，混勻后按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》（GB 4789.2—2016）[1]方法計(jì)數(shù)。同時以加入10 mL生理鹽水作為對照組進(jìn)行計(jì)數(shù)。培養(yǎng)基為平板計(jì)數(shù)瓊脂，36 ℃培養(yǎng)48 h。

1.3.3 黃酒中菌落總數(shù)測定

根據(jù)回收率測定結(jié)果，選擇回收率較高的菌液來污染黃酒菌株。將同一份黃酒樣品分成11 份，每份50 mL，取稀釋度適宜的菌液1 mL 加入每份樣品中作為污染的黃酒樣品。按照標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.2—2016[1]方法，無菌環(huán)境下量取樣品25 mL，置于盛有225 mL 無菌生理鹽水的滅菌杯內(nèi)，混勻，制成1 ∶10供試液。取上述供試液1 mL，沿管壁緩慢注于9 mL無菌生理鹽水的試管中，混勻，制成1 ∶100 供試液。選擇1 ∶10、1 ∶100 兩個稀釋度進(jìn)行計(jì)數(shù)。取1 mL 樣品勻液于無菌平皿中，每個稀釋度做2 個平皿。同時，分別吸取1 mL 稀釋液加入2 個無菌平皿中，作為空白對照。使用平板計(jì)數(shù)（Plate Count Agar，PCA）培養(yǎng)基注皿。于36 ℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)，11 組菌落總數(shù)計(jì)數(shù)取稀釋度為100的計(jì)數(shù)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌液計(jì)數(shù)結(jié)果

結(jié)果得到3 種菌液的濃度分別為大腸埃希氏8.3×108CFU/mL、金黃色葡萄球菌7.1×107CFU/mL、鼠傷寒沙門氏菌5.5×108CFU/mL，詳見表1。

表1 菌液計(jì)數(shù)結(jié)果（單位：CFU/mL）

2.2 回收率測定結(jié)果

根據(jù)表2 的結(jié)果，可以看出，該黃酒樣品對本次實(shí)驗(yàn)使用的3 種菌的抑菌作用基本都不大，但相較于金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌，對大腸埃希氏菌的回收率影響更小，所以在之后的不確定度評定實(shí)驗(yàn)中選擇大腸埃希氏菌作為本次評定的污染菌株進(jìn)行研究。

表2 回收率測定結(jié)果（單位：CFU/mL）

2.3 黃酒菌落總數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果

11 份大腸埃希菌污染黃酒樣品分析數(shù)據(jù)見表3。

表3 11 組平行樣測定結(jié)果（單位：CFU/mL）

3 不確定度評定

3.1 不確定度來源分析

在日常檢驗(yàn)過程中影響菌落總數(shù)的檢測結(jié)果的因素有很多，如檢驗(yàn)人員、環(huán)境、時間、操作等都能對檢驗(yàn)結(jié)果構(gòu)成不同程度的影響。根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行分析，將不確定度的來源分成系統(tǒng)誤差（A 類）和隨機(jī)誤差（B 類）。A 類主要包括樣品處理（稀釋、稱量、均勻度等）和儀器設(shè)備（移液器、培養(yǎng)箱、電子天平等），B 類主要包括重復(fù)測定過程中的測試環(huán)境、操作人員、培養(yǎng)條件（包括培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度）等。而微生物學(xué)科屬于非嚴(yán)格性、非度量學(xué)一類，A 類不確定度對合成不確定度貢獻(xiàn)較小，重復(fù)測量帶來的不確定度占主要部分[2]。因此，本次不確定度評定只考慮其重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度，即對B 類誤差的不確定度進(jìn)行評定。

3.2 不確定度計(jì)算

3.2.1 實(shí)驗(yàn)重復(fù)性引入的不確定度

對11 份黃酒樣品按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》 （GB 4789.2—2016）進(jìn)行檢測，得到數(shù)據(jù)見表3。由于實(shí)際數(shù)據(jù)相差較大，按照取對數(shù)值的方式進(jìn)行數(shù)據(jù)處理后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表3。

根據(jù)表3 數(shù)據(jù)，再利用貝塞爾公式，計(jì)算出樣品標(biāo)準(zhǔn)差[3-5]：

得到不確定度為：

3.2.2 擴(kuò)展不確定度

取 置 信 水 平95%，v=11， 查t分 布 表，得k=t95(11)=2.201。故擴(kuò)展不確定度U=kUc=2.201×0.059 3=0.130。

4 結(jié)論與討論

當(dāng)檢驗(yàn)記錄以11 次檢驗(yàn)對數(shù)值的平均值表示時，其取值區(qū)間分布于-0.130 ～0.130，其對數(shù)值再取反對數(shù)，得取值區(qū)間分布。樣品菌落總數(shù)lgx=lgX±0.130）。11 個樣品檢驗(yàn)結(jié)果平均值為26 CFU/mL，為1.398 84，該樣品的菌落總數(shù)的lgx值為1.399±0.130，分布于1.269 ～1.529，取反對數(shù)，其結(jié)果分布于18.578 ～33.806 CFU/mL，即第11 個樣品菌落總數(shù)的檢驗(yàn)結(jié)果可估算為18 ～34 CFU/mL。

本次實(shí)驗(yàn)是按照食品微生物學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)來設(shè)計(jì)完成，符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求對黃酒的檢驗(yàn)方法。此次研究根據(jù)不同菌種在黃酒中的回收率選出受黃酒影響較小的菌株加入本身含菌量較少的黃酒中，從而模擬最可能的實(shí)際生產(chǎn)情況，提高了本次不確定度評定的可靠性。黃酒產(chǎn)品的日常檢驗(yàn)中雖然沒有特別針對菌落總數(shù)的限量要求，但是其生產(chǎn)過程有大量微生物繁殖，所以菌落總數(shù)是其出廠檢驗(yàn)的常規(guī)項(xiàng)目。很多酒廠都有自己的微生物分析實(shí)驗(yàn)室，在進(jìn)行菌落總數(shù)的不確定度評定時可以參考此法。此法也可用于對其他不同品類的樣品進(jìn)行不確定度評定，從而確保實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。