液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定肥料中15種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

朱海榮 張娟 劉爽 孫文丹 齊云 張開亮

摘要 [目的]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立同時(shí)測(cè)定肥料中15種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的方法。[方法]樣品經(jīng)含0.1%甲酸的乙腈溶液提取，Agilent SB-C18（3.0 mm×150 mm，2.7 μm）色譜柱分離，甲醇和0.01%甲酸溶液作為流動(dòng)相梯度洗脫，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，外標(biāo)法定量。[結(jié)果]15種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在各自的線性范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（ r >0.996），加標(biāo)回收率為78.62%～113.12%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.11%～13.65%，檢出限為0.03～0.20 μg/g。[結(jié)論]該方法樣品前處理快捷高效，定性、定量準(zhǔn)確，適用于肥料中15種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的同時(shí)檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 肥料;植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

中圖分類號(hào) S482.8? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2022）11-0173-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.11.045

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Rapid Determination of 15 Plant Growth Regulators in Fertilizers by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHU Hai-rong， ZHANG Juan， LIU Shuang et al

（Shandong Institute for Product Quality Inspection， Jinan，Shandong 250100）

Abstract [Objective] A method was established for the simultaneous determination of 15 plant growth regulators in fertilizers by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. [Method]The samples were extracted with acetonitrile solution containing 0.1% formic acid and separated on an Agilent SB-C18 （3.0 mm×150 mm， 2.7 μm） column. The mobile phase was gradient eluted with methanol and 0.01% formic acid solution. The multiple reaction monitoring mode was used for quantitative analysis. [Result]The 15 plant growth regulators showed a good linear relationship in their respective linear ranges （ r >0.996）， the recovery rates of standard additions were 78.62%-113.11%， and the relative standard deviations （RSD） were 2.11%-13.65%. The detection limit was 0.03-0.20 μg/g.[Conclusion]The method was fast and efficient in sample pretreatment， accurate in qualitative and quantitative determination， and was suitable for simultaneous determination of 15 plant growth regulators in fertilizers.

Key words Fertilizers;Plant growth regulators;Liquid chromatography-tandem mass spectrometry

近年來(lái)各類植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑產(chǎn)品在甘蔗、水稻、瓜果蔬菜等領(lǐng)域大規(guī)模推廣應(yīng)用[1-2]，對(duì)改善作物品質(zhì)、提高作物產(chǎn)量起到了重要作用。但植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑具有一定毒性，若使用不規(guī)范，將對(duì)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全、人體健康和生態(tài)環(huán)境等方面產(chǎn)生潛在危害[3-7]。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑屬于農(nóng)藥管理范疇，原農(nóng)業(yè)部明確指出，重點(diǎn)查處水溶性肥料添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的行為。隨著植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的廣泛應(yīng)用，一些違規(guī)現(xiàn)象開始出現(xiàn)，部分肥料生產(chǎn)廠商以在肥料中隱性添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的非法方式來(lái)提高肥效、搶占市場(chǎng)，嚴(yán)重?cái)_亂了肥料市場(chǎng)秩序。此類“藥肥”產(chǎn)品一旦投入使用，極易與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑產(chǎn)品重復(fù)使用，將給農(nóng)作物產(chǎn)品質(zhì)量安全和食品安全帶來(lái)隱患。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類多樣、行業(yè)發(fā)展迅速，多種目標(biāo)物同時(shí)檢測(cè)難度較大。目前借鑒相對(duì)成熟和完善的食品中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留檢測(cè)方法[8-12]，建立系統(tǒng)、全面的多組分同時(shí)快速分析技術(shù)，是現(xiàn)階段化肥行業(yè)亟待解決的主要問題之一。近幾年出現(xiàn)的肥料中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑檢測(cè)技術(shù)主要以色譜法為主[13-16]，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS）法因靈敏度強(qiáng)、可篩查目標(biāo)物種類多、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度高而具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，2021年發(fā)布的GB/T 40459—2021提供了肥料中13種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的LC-MS篩選法[17]，該研究在該技術(shù)基礎(chǔ)上增加應(yīng)用范圍較廣的矮壯素和助壯素為研究對(duì)象，采用超聲提取法，以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜為檢測(cè)手段，以保留時(shí)間和特征離子進(jìn)行陽(yáng)性結(jié)果確證，旨在建立適用范圍廣、可操作性強(qiáng)的快捷檢測(cè)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1260-6460液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫公司，配電噴霧離子源及自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)）;KQ-700DB超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司，具有自動(dòng)掃頻功能）;HC-3618R高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司，溫控范圍-20～40 ℃）;ML204/02十萬(wàn)分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司];ZX/XH-D漩渦混合器（上海旌派儀器有限公司）。

1.2 試劑

標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司，純度≥97.0%，包括矮壯素、助壯素、赤霉酸、吲哚-3-乙酸、5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉、2-硝基苯酚鈉、4-硝基苯酚鈉、6-芐氨基嘌呤、脫落酸、吲哚丁酸、萘乙酸、氯吡脲、2，4-二氯苯氧乙酸（簡(jiǎn)稱2，4-D）、多效唑、烯效唑;乙腈、甲醇，色譜純，購(gòu)自美國(guó)Fisher公司;甲酸（色譜純），購(gòu)自Honeywell公司;試驗(yàn)用水為超純水。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。

1.3.1.1

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別精確稱取適量各標(biāo)準(zhǔn)品（精確至0.000 1 g）于10 mL容量瓶，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為1 mg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液，-18 ℃條件下保存，可存放90 d。

1.3.1.2

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。準(zhǔn)確移取適量體積標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇-0.01%甲酸水（10∶90， V∶V ）配制系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中2-硝基苯酚鈉、4-硝基苯酚鈉、氯吡脲、烯效唑、多效唑、6-芐氨基嘌呤、矮壯素、助壯素系列標(biāo)準(zhǔn)工作液均為2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/L，5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉、2，4-D、脫落酸、萘乙酸、赤霉酸、吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液均為25、50、100、250、500、1 000 μg/L。

1.3.2 樣品前處理。

稱取制備好的肥料樣品0.1～0.5 g（精確至0.000 1 g）于15 mL螺旋蓋聚丙烯離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL添加0.1%甲酸的乙腈溶液，渦旋1 min后室溫超聲提取30 min，以6 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，取約1 mL上清液過0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜，待測(cè)。

1.3.3 色譜-質(zhì)譜條件。

1.3.3.1 液相色譜條件。色譜柱為Agilent SB-C18（3.0 mm×150 mm，2.7 μm）;流動(dòng)相為0.01%甲酸水-甲醇;流速0.3 mL/min;柱溫35 ℃;進(jìn)樣量2 μL;梯度洗脫程序見表1。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件。該分析方法使用了正負(fù)離子切換掃描模式下運(yùn)行的Agilent 6460精確質(zhì)量四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，離子源類型為噴射流電噴霧離子源，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式;噴霧電壓為3 500 V（正極）和-2 000 V（負(fù)極）;干燥氣溫度為260 ℃，鞘氣溫度為300 ℃，干燥氣和鞘氣流速均為8 mL/min;霧化氣壓力為206.8 kPa。質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

以濃度為1 mg/L單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液開啟質(zhì)譜單針自動(dòng)進(jìn)樣Scan模式，發(fā)現(xiàn)氯吡脲、烯效唑、多效唑、6-芐氨基嘌呤、矮壯素、助壯素6種目標(biāo)物采用正離子掃描模式，其余9種目標(biāo)物采用負(fù)離子掃描模式可產(chǎn)生穩(wěn)定的母離子;在SIM模式下獲得相應(yīng)的碎片離子;在Product ion模式下優(yōu)化目標(biāo)化合物母離子錐孔電壓，選擇兩對(duì)穩(wěn)定、響應(yīng)值高的特征碎片離子;繼而利用MRM模式獲得子離子的最佳碰撞電壓及干燥氣溫度等參數(shù)，確保目標(biāo)化合物響應(yīng)盡可能高、干擾盡可能降低，提取離子質(zhì)譜圖見圖1。為提高儀器靈敏度和準(zhǔn)確度，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量軸偏離時(shí)，應(yīng)使用校準(zhǔn)標(biāo)樣（G1969-85000）對(duì)質(zhì)譜進(jìn)行調(diào)諧。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱的選擇。

最初嘗試了窄徑細(xì)顆粒的Agilent SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱，但15種目標(biāo)物極性差異較大，強(qiáng)極性化合物矮壯素、助壯素難以分離且出峰時(shí)間在1 min左右，極性干擾物對(duì)矮壯素、助壯素產(chǎn)生一定干擾。使用粒徑更大、柱長(zhǎng)更長(zhǎng)的Agilent SB-C18（3.0 mm×150 mm，2.7 μm）色譜柱后發(fā)現(xiàn)，15種目標(biāo)物化合物的保留時(shí)間均在2 min以后，分離度明顯得到了提高，共流出物干擾亦有所降低（圖2）。因此，該試驗(yàn)選擇效果更佳的Agilent SB-C18（3.0 mm×150 mm，2.7 μm）作為分離柱，再利用 Masshunter 采集軟件流路切換功能，可顯著減小極性干擾物的影響，得到較高的回收率。

2.2.2 流動(dòng)相體系的選擇。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分離多種目標(biāo)物，選擇流動(dòng)相時(shí)，需要兼顧各目標(biāo)化合物的響應(yīng)強(qiáng)度、峰形及分離性能，該試驗(yàn)選擇甲醇或乙腈為強(qiáng)洗脫溶劑，水、0.01%甲酸水溶液或5 mmol/L乙酸銨為弱洗脫溶劑，并對(duì)其不同搭配的二元流動(dòng)相體系分離性能進(jìn)行了綜合性比較。結(jié)果表明，以甲醇為強(qiáng)洗脫溶劑時(shí)，各目標(biāo)化合物響應(yīng)良好，且分離性能優(yōu)于乙腈;弱洗脫溶劑中乙酸銨的加入未明顯提高目標(biāo)化合物的分離度，甲酸的加入可促進(jìn)目標(biāo)化合物的分離并能顯著改善峰形。選擇甲醇和0.01%甲酸水溶液作為流動(dòng)相，在優(yōu)化的梯度洗脫條件下，可在14 min內(nèi)將15種目標(biāo)物從色譜柱中洗脫。

2.3 提取劑的選擇

大部分植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在有機(jī)溶劑中溶解度良好，以含氨基酸水溶肥料為基質(zhì)對(duì)象，考察了甲醇、含0.1%甲酸的甲醇、乙腈、含0.1%甲酸的乙腈4種提取劑對(duì)15種目標(biāo)化合物的提取效果。結(jié)果表明，提取溶劑中加入適量甲酸可有效抑制赤霉酸、萘乙酸、吲哚丁酸等含羧基酸性目標(biāo)物在提取劑中的解離。提取劑為0.1%甲酸的乙腈溶液時(shí)，整體提取效果優(yōu)于其他4種提取劑，矮壯素和助壯素的回收率在80%左右，其余13種目標(biāo)物回收率大于83%。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)

基質(zhì)效應(yīng)（ME）是準(zhǔn)確分析目標(biāo)物的常見干擾因子之一[18]。若80%≤ME≤120%，表示基質(zhì)效應(yīng)較弱，可忽略;若ME>120%，表示基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)顯著;若ME<80%，表示基質(zhì)抑制效應(yīng)顯著[19]。試驗(yàn)結(jié)果表明，15種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的基質(zhì)效應(yīng)（ME）在82.6%～115.4%（表3），可忽略。因此，該試驗(yàn)未建立基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5 線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限

以甲醇-0.01%甲酸水（10∶90， V∶V ）配制系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照“1.3.3”條件對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液以濃度由低至高的順序進(jìn)行測(cè)定。以15種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的質(zhì)譜響應(yīng)值為縱坐標(biāo)（ Y ），對(duì)應(yīng)的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為橫坐標(biāo)（ X ，μg/L），繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，以加標(biāo)樣品信噪比（ S/N ）為3時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度確定方法檢出限，結(jié)果見表4。從表4可以看出，各目標(biāo)物在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（ r >0.996），矮壯素和助壯素檢出限為0.04 μg/g，其余目標(biāo)物的檢出限低于GB/T 40459中公布的數(shù)據(jù)。

2.6 方法的準(zhǔn)確度和精密度

使用優(yōu)化的樣品前處理和儀器方法，對(duì)方法性能進(jìn)行了準(zhǔn)確度和精密度評(píng)估。以水溶肥料和復(fù)混肥料樣品為代表基質(zhì)，稱取樣品0.5 g（精確至0.000 1 g），分別添加高濃度、中濃度和低濃度3個(gè)水平，每個(gè)水平重復(fù)進(jìn)行6次試驗(yàn)，進(jìn)行加標(biāo)回收測(cè)試和精密度試驗(yàn)，計(jì)算結(jié)果見表5。從表5可以看出，各樣品的加標(biāo)回收率在78.62%～113.12%，RSD為2.11%～13.65%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，滿足準(zhǔn)確定量的要求。

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用所建立的分析方法對(duì)市售20批次肥料樣品進(jìn)行測(cè)定，并以Agilent MassHunter 定性分析軟件的“質(zhì)量數(shù)和保留時(shí)間”功能選擇定性離子對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行確證。結(jié)果顯示，4批次樣品檢出赤霉酸、多效唑或6-芐氨基嘌呤，總體檢出率為20%。其中1批次樣品赤霉酸含量為0.12%，1批次樣品多效唑含量為1.33%，1批次樣品6-芐氨基嘌呤含量為0.02%;另有1批次樣品同時(shí)檢出多效唑和6-芐氨基嘌呤，含量分別為0.96%和0.15%。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)基于超聲提取建立的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，實(shí)現(xiàn)了高通量快速分析肥料中15種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏，準(zhǔn)確度、精密度等均滿足方法學(xué)指標(biāo)，擴(kuò)大了現(xiàn)有國(guó)標(biāo)的應(yīng)用范圍，可用于肥料中多種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的快速篩選;與現(xiàn)有方法相比，提供了更高的通量，可為肥料產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和質(zhì)量控制提供可靠的技術(shù)依據(jù)。

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