γ-氨基丁酸及其在谷物發(fā)酵食品中的研究進展

俞德慧，楊楊，陳鳳蓮，范婧，邊鑫，王冰，王夢桔，劉思淼，邢文靜，張娜

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱，150028)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一種天然的非蛋白質(zhì)氨基酸，是由谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)及其輔助因子磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate，PLP)催化L-谷氨酸(L-glutamic acid，L-Glu)或其鹽發(fā)生不可逆α-脫羧反應(yīng)合成(圖1)。GAD存在于細(xì)菌、真菌、植物、昆蟲(如蟑螂、蚱蜢、蛾子、蜜蜂和蒼蠅)中，在哺乳動物大腦中也廣泛存在[1]。GABA是人類神經(jīng)系統(tǒng)中重要的活性物質(zhì)，具有抗抑郁、鎮(zhèn)靜、抗高血壓、抗癌、抗糖尿病等潛在的健康益處[2]。GABA在動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍組織上起抑制神經(jīng)遞質(zhì)的作用；在細(xì)菌中作為一種抵御低pH脅迫的保護機制；在植物中，生物和非生物的脅迫會積累琥珀酸半醛，導(dǎo)致GABA轉(zhuǎn)氨酶受到抑制，促使GABA積累。2001年，日本厚生勞動省正式將GABA列入食品級，2009年9月GABA也被我國衛(wèi)生部列入新資源食品，在食品生產(chǎn)和加工過程中使用已給予批準(zhǔn)。目前，植物富集法中GABA的濃度較低，低GABA水平的產(chǎn)品不足以將其益處傳遞給人類[3]。雖有研究人員已嘗試用化學(xué)方法生產(chǎn)GABA，但因其對環(huán)境不友好，導(dǎo)致人們對它的接受程度越來越低。而微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GABA產(chǎn)率高、安全性好，條件溫和[4]，相對前兩種方法具有優(yōu)勢。因此，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用較多。

圖1 谷氨酸脫羧形成GABAFig.1 Decarboxylation of glutamate to form GABA

谷物是膳食碳水化合物、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)和纖維最重要的來源之一，為人類提供約2/3的熱量攝入。谷物中還有許多生理活性物質(zhì)，如多糖、多酚、GABA等，具有降血糖、抗氧化等功能。與動物源產(chǎn)品或乳制品相比，谷物作為原料存在一些缺陷(如某些氨基酸的缺乏、存在抗?fàn)I養(yǎng)化合物等)，但發(fā)酵谷物在營養(yǎng)上卻優(yōu)于天然谷物。發(fā)酵不僅可以改善谷物的保質(zhì)期、感官特性，還會影響最終產(chǎn)品的功能性質(zhì)。隨著消費者健康意識的持續(xù)提升，谷物發(fā)酵產(chǎn)品因具有獨特的營養(yǎng)和功能屬性吸引越來越多的消費者。研究發(fā)現(xiàn)微生物發(fā)酵可以積累谷物中的GABA[5]。LI等[6]從實驗室篩出一株產(chǎn)GABA的植物乳桿菌8014，并用其與紅霉菌20-2以1∶2的干重比發(fā)酵大米40 h，發(fā)酵后大米中GABA含量達到29.9 mg/g。

目前對于發(fā)酵谷物中GABA的概述還不太全面。因此，本文綜述了GABA的作用機理、代謝途徑、合成方法及其在健康方面的生理功能，闡述了谷物發(fā)酵食品中GABA的研究現(xiàn)狀，為開發(fā)更多富含GABA的谷物發(fā)酵食品提供參考。

1 γ-氨基丁酸的概述

1.1 GABA作用機理

GABA在動物體內(nèi)是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它從一個神經(jīng)元釋放出來，將信息傳遞給另一個神經(jīng)元。成千上萬的GABA分子儲存在軸突末端的囊泡中，囊泡與神經(jīng)元膜融合，通過胞吐作用釋放GABA。釋放后的GABA從突觸空間擴散到突觸后神經(jīng)元[7]，進而與GABA受體結(jié)合而發(fā)揮抑制突觸的作用。這種結(jié)合導(dǎo)致離子通道開放，允許K+流出細(xì)胞，Cl-流入細(xì)胞，跨膜電位發(fā)生負(fù)變化，引起超極化，從而降低神經(jīng)元的興奮性[8](圖2)。未與受體結(jié)合的GABA部分被突觸間隙中的酶降解，或者通過轉(zhuǎn)運蛋白或再攝取泵主動轉(zhuǎn)運，被帶回到突觸前軸突末端。除大腦外，GABA還存在于內(nèi)分泌胰腺中[9]，由β細(xì)胞產(chǎn)生，與胰島α細(xì)胞相鄰的胰島受體結(jié)合，抑制胰高血糖素分泌[10]。GABA不僅可以刺激β細(xì)胞復(fù)制，維持β細(xì)胞存活，還可以將α細(xì)胞轉(zhuǎn)化為β細(xì)胞。

圖2 GABA作用機理圖Fig.2 GABA mechanism of action diagram

1.2 γ-氨基丁酸代謝途徑

目前，產(chǎn)生GABA的途徑主要分為2種：一種是GABA支路，另一種是由多胺(腐胺、亞精胺)降解的中間產(chǎn)物(4-氨基丁醛)轉(zhuǎn)化形成。1970年BALZS等[11]首次在豚鼠細(xì)胞研究中描述了GABA支路。該支路是三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)循環(huán)的一條支路，在動、植物及微生物中廣泛存在，該途徑主要包括以下3個步驟：首先是α-酮戊二酸在轉(zhuǎn)氨酶的作用下形成L-Glu，然后在GAD的催化下，L-Glu脫羧形成GABA；其中GAD是一種限速酶，它需要PLP作為輔助因子[12]，GAD表達為2種主要的亞型，大小分別為65和67 kDa，是2個不同基因的產(chǎn)物。在GABA能神經(jīng)元中的這兩種GAD亞型分布是不同的：GAD67分布于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞體中分布較多，而GAD65在軸突終末高度富集，并與突觸小泡有關(guān)[13]。動物來源的GAD最適pH為7.0，顯中性，植物來源的GAD最適pH集中在5.5～6.0，呈弱酸性。微生物來源的GAD在酸性范圍內(nèi)具有活性，最適pH在3.8～5.0，大部分集中在4.0～5.0，pH偏中性時酶活性消失[14]；最后，GABA與丙酮酸在GABA轉(zhuǎn)氨酶(γ-aminobutyric acid transaminase，GABASE)的作用下發(fā)生轉(zhuǎn)氨反應(yīng)生成琥珀酸半醛(succinic semialdehyde，SSA)和丙氨酸(alanine，Ala)；SSA在琥珀酸半醛脫氫酶(succinic semialdehyde dehydrogenase，SSADH)的催化下生成琥珀酸后進入TCA循環(huán)[15](圖3)，構(gòu)成TCA循環(huán)的一條支路。

圖3 GABA代謝途徑Fig.3 GABA metabolic pathway

另一條途徑是由氧化酶(二胺氧化酶、多胺氧化酶)降解多胺(腐胺、精胺、亞精胺)形成多胺中間產(chǎn)物(4-氨基丁醛)，多胺中間產(chǎn)物在脫氫酶(4-氨基丁醛脫氫酶)的催化下形成GABA(圖4)，與第一條途經(jīng)相比，該途徑生成的GABA較少，不是GABA富集生產(chǎn)的主要途徑[16]。

圖4 多胺降解途徑Fig.4 Polyamine degradation pathway

1.3 γ-氨基丁酸的生理功能

GABA具有生物活性，其作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在神經(jīng)系統(tǒng)中起到了重要作用，近年來越來越引起人們的興趣[17]。GABA的抑制作用是與GABA能受體系統(tǒng)結(jié)合引起的，GABA能系統(tǒng)由GABAA、GABAB和GABAC這3個特定的受體組成[18]。通過這些受體，GABA可以調(diào)節(jié)情緒、睡眠障礙。在焦慮、高血壓、癌癥、癲癇等疾病中也證明了其有益的效果。

1.3.1 治療焦慮

焦慮癥是指一種以恐懼感和焦慮感為特征的精神障礙，這種疾病通常與杏仁核多動有關(guān)。目前大多數(shù)焦慮障礙的原因未知，但是研究指出GABA與焦慮癥的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，成為最令人關(guān)注的介質(zhì)之一[19]。可以使用能夠調(diào)節(jié)單胺能神經(jīng)傳遞、GABA能傳遞或 GABA受體的藥物進行治療[20]。由于GABA受體是抗焦慮藥物的活性部位，從而證實了GABA是治療焦慮的關(guān)鍵靶點。研究發(fā)現(xiàn)，單次口服GABA可顯著增加人大腦中的α波，降低β波，GABA可誘導(dǎo)放松并減輕焦慮。HE等[21]發(fā)現(xiàn)在0.5～2 mg/kg劑量范圍內(nèi)，GABA各劑量組均能明顯延長小鼠張開雙臂的時間和次數(shù)，降低焦慮指數(shù)。

1.3.2 降血壓

GABA對人體最重要的健康生理作用就是治療心血管疾病。世界衛(wèi)生組織認(rèn)為高血壓可能會導(dǎo)致心臟病的發(fā)作，也會引起中風(fēng)，導(dǎo)致每年數(shù)百萬人死亡。其中GABA降低血壓有2種方式：一種是作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)脊髓的血管運動中樞，從而使血管擴張；另一種是通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)活性，減少血管緊張素Ⅱ合成，從而使血壓降低。因此，ACE是控制高血壓的治療靶點之一。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳中植物乳桿菌NTU102可以產(chǎn)生GABA，表現(xiàn)出較高的ACE抑制活性[22]。

1.3.3 抗糖尿病

糖尿病是由于胰島功能減退而引起碳水化合物代謝素亂的代謝障礙性疾病。其可以通過藥物干預(yù)來控制，然而，藥物的降血糖作用會產(chǎn)生耐藥性等副作用，甚至有毒性。因此，飲食和運動成為調(diào)節(jié)糖尿病疾病的替代療法。值得注意的是，GABA和富含GABA的產(chǎn)品已被證明是降低血糖、減輕胰島素抵抗、刺激胰島素釋放和預(yù)防胰腺損傷的有效藥物。GABA可以通過產(chǎn)生膜去極化和Ca2+流入、激活PI3-K/Akt依賴性生長和存活通路以及恢復(fù)β細(xì)胞質(zhì)量來增強胰島細(xì)胞功能。

1.3.4 抗癌

癌癥與不受調(diào)控的細(xì)胞增殖、凋亡抑制、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，是世界范圍內(nèi)主要的致死原因之一。化療和外科手術(shù)是目前治療癌癥的方法，然而，這些療法也有各種缺陷及副作用，且可能復(fù)發(fā)。GABA作為有應(yīng)用前景的化合物，通過與其受體相結(jié)合使之激活，進而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[23]。研究發(fā)現(xiàn)GABA在乳腺癌中有明顯的預(yù)后價值，患者體內(nèi)GABA含量越高，生存預(yù)后越好[24]。

1.3.5 治療癲癇

癲癇是一組異質(zhì)性疾病，其特征是易復(fù)發(fā)性癲癇發(fā)作和大腦網(wǎng)絡(luò)興奮—抑制平衡的改變。雖然大多數(shù)癲癇患者使用抗癲癇藥物就可以控制病情，但還有部分患者通常會出現(xiàn)耐藥性或難治性癲癇。由于抗癲癇藥物不能完全改善疾病，僅抑制癲癇發(fā)作，即使在完全控制癲癇發(fā)作的患者中，癲癇的并發(fā)癥(如認(rèn)知和情緒功能障礙)也可能持續(xù)存在。目前代替藥物的治療方法有切除癲癇腦組織和周圍區(qū)域、生酮飲食、刺激迷走神經(jīng)等，但這些治療方法并不適用于所有患者，它們或效率中等，或存在副作用[25]。研究發(fā)現(xiàn)缺乏GABA會引發(fā)癲癇，其在控制癲癇的興奮性方面具有重大作用。GABA補充劑可減輕癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度，并提供潛在的補救措施[26]。

上述生理功能除外，GABA還有具有治療哮喘[27]、緩解疲勞、保護神經(jīng)、抗氧化、改善脂質(zhì)代謝、防止動脈硬化、保肝保腎、保護腸道等作用。其作為一種生物活性化合物，具有許多有益健康的作用。

1.3.6 富含γ-氨基丁酸食品的生理功能

富含GABA的食品也具有相應(yīng)的生理功能。研究發(fā)現(xiàn)富含GABA的烏龍茶顯著降低了急性應(yīng)激，改變了心率變異性，增加了迷走神經(jīng)(副交感神經(jīng))活性，降低了應(yīng)激反應(yīng)，有緩解焦慮的作用[28]。研究發(fā)現(xiàn)，巨胚黑紫色水稻中有較高含量的GABA，能夠顯著降低去卵巢大鼠的血糖和血漿胰島素水平、脂肪因子濃度和肝臟葡萄糖調(diào)節(jié)酶活性[29]。在正常高血壓和臨界高血壓的人群中，服用富含 GABA 的小球藻膳食補充劑可以顯著降低收縮壓和舒張壓[30]。發(fā)酵食品中也含有大量的GABA，富含GABA的發(fā)酵大豆日糧可有效降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓[31]?？诜凌税l(fā)酵茶熱水提取物可顯著降低麥芽糖負(fù)荷的Sprague-Dawley大鼠的血糖水平和血清胰島素分泌[32]。還有報告稱，補充鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌等益生菌可降低動物模型的癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度，增加GABA活性，改善氧化平衡[33]。由此可見，富含GABA的食品可用作抗焦慮、抗糖尿病、降血壓、抗癲癇等功能性食品，維持健康，預(yù)防疾病的并發(fā)癥。

1.4 γ-氨基丁酸的生理功能

目前制備GABA的常用方法有以下3種(表1)。

表1 GABA合成制備方法Table 1 Synthesis and preparation method of GABA

合成GABA最常見的化學(xué)方法是鄰苯二甲酰亞胺鉀在180 ℃高溫條件下與γ-氯丁氰發(fā)生反應(yīng)，其產(chǎn)物再與濃H2SO4反應(yīng)水解得到GABA(圖5)。以毗咯烷酮作為原料，經(jīng)Ca(OH)2、NH4HCO3水解制得GABA(圖6)是另一種化學(xué)合成方法[34]。反應(yīng)時間短，產(chǎn)率高是化學(xué)合成法的優(yōu)點，但是因其反應(yīng)條件劇烈，化學(xué)試劑有毒、副產(chǎn)物多，安全性差等缺點在食品領(lǐng)域不予應(yīng)用。

圖5 鄰苯二甲酰亞氨鉀合成GABAFig.5 Synthesis of GABA from potassium phthalimide and γ-chlorobutyronitrile

圖6 毗咯烷酮合成GABAFig.6 GABA made from rolidonee

植物富集法是植物細(xì)胞受到各種環(huán)境脅迫，例如高溫脅迫、低溫脅迫、鹽脅迫、低氧脅迫、機械損傷等使GABA積累。GABA的積累主要是通過GAD介導(dǎo)的。因此，促進GAD活性有助于富集GABA。GAD依賴PLP，其活性可被PLP促進。此外，在植物中GAD還是一種能夠結(jié)合Ca2+/CaM的結(jié)合蛋白，其活性也受Ca2+/CaM刺激。機械損傷和低氧脅迫會使植物細(xì)胞質(zhì)中H+的濃度增加，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)酸化，滿足GAD催化L-Glu生成GABA的條件，使GABA累積。糙米在30 ℃浸泡，35 ℃發(fā)芽36 h的最佳溫度條件下，通過優(yōu)化酸度、L-Glu含量，可以在較短發(fā)芽時間內(nèi)獲得高水平GABA產(chǎn)量[35]。鹽脅迫下番茄果實中GABA的鮮重含量比對照果實高了1倍多，進一步說明鹽脅迫可以提高植物中GABA的含量[36]。植物富集法雖然工藝簡單，安全性好，但GABA產(chǎn)量太低，無法應(yīng)用于醫(yī)藥和食品添加劑中。

微生物發(fā)酵法是以富含谷氨酸的物質(zhì)為原料，利用乳酸菌、酵母菌、霉菌等微生物發(fā)酵生成富含GABA的食品。大腸桿菌是最早用于生產(chǎn)GABA的微生物，但是大腸桿菌作為生產(chǎn)菌株在安全上存在隱患，因此不能直接應(yīng)用于醫(yī)藥或食品領(lǐng)域中。乳酸菌廣泛存在于人和動植物體內(nèi)，是一種安全級微生物，對人類健康有益生作用。研究表明乳酸發(fā)酵使高粱中GABA含量顯著增加。乳酸乳球菌 RO50發(fā)酵大米后生產(chǎn)出富含GABA的米粉，GABA含量達到1.5 mg/g[37]。酵母菌是一種重要的微生物資源，廣泛應(yīng)用于釀酒、飲料領(lǐng)域。有研究從中國傳統(tǒng)泡菜中分離鑒定出一株高產(chǎn)GABA的優(yōu)良菌株—釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)SC125。并且以釀酒酵母SC125和植物乳桿菌BC114為合作菌種發(fā)酵桑葚，生產(chǎn)出一種富含GABA的新型飲料[38]。還有研究表明從農(nóng)業(yè)廢渣生產(chǎn)中篩選出的紅曲霉(Monascussanguineus)以椰子油蛋糕為基質(zhì)，其GABA產(chǎn)量可達15.53 mg/g[39]。由此可見，在食品工業(yè)中利用微生物生產(chǎn)GABA的應(yīng)用有許多，微生物發(fā)酵法比化學(xué)生產(chǎn)GABA更安全、更環(huán)保。此外，與植物和動物生產(chǎn)相比，利用微生物更容易控制生產(chǎn)條件。

2 γ-氨基丁酸與谷物發(fā)酵食品

2.1 產(chǎn)γ-氨基丁酸的微生物

已經(jīng)確定GABA是促進人體健康的生物活性成分，微生物發(fā)酵產(chǎn)GABA也是目前比較主流的方法。然而并非所有微生物都能產(chǎn)生GABA，具有較高GAD活性的菌株與谷氨酸含量較高的食品基質(zhì)相結(jié)合，才有望在市場上實現(xiàn)富含GABA發(fā)酵食品的商業(yè)化。由于GABA和乳酸菌都具有促進健康的特性，因此可利用乳酸菌在食品中生產(chǎn)GABA吸引越來越多的消費者。已有研究發(fā)現(xiàn)在豆奶和小麥飲料等谷物制品中可以通過乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生GABA。通過發(fā)酵產(chǎn)生 GABA 的常見乳酸菌包括乳桿菌屬和乳球菌屬。副干酪乳桿菌、清酒乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等是產(chǎn)生GABA的主要乳桿菌。大多數(shù)研究結(jié)果表明，短乳桿菌具有產(chǎn)生GABA的能力，這歸因于GAD系統(tǒng)作為其抗酸的主要策略。另外嗜熱乳桿菌也可以產(chǎn)GABA。據(jù)報道，嗜熱乳桿菌IFO13957和嗜熱乳桿菌APC151具有產(chǎn)GABA的能力，但商業(yè)嗜熱乳桿菌無法生產(chǎn)GABA[40]。GAD也在酵母中被鑒定出來，例如從發(fā)酵產(chǎn)物中分離出來的釀酒酵母和馬克斯克魯維酵母[41]，但釀酒酵母產(chǎn)GABA的活性低于植物乳桿菌，這可能是釀酒酵母利用GABA作為氮源所致。米曲霉是一種霉菌，用于發(fā)酵米曲釀制清酒，研究表明米曲霉可以產(chǎn)生GABA。少孢根霉和米根霉是用于制備發(fā)酵大豆的霉菌，其中少孢根霉IFO32002可產(chǎn)生1.770 mg/100 g的GABA[31]。

2.2 谷物發(fā)酵食品中的γ-氨基丁酸

微生物發(fā)酵法富集谷物中的GABA，通常是以玉米、大米、小麥、小米等富含谷氨酸的谷物為原料，利用乳酸菌、酵母菌、霉菌進行發(fā)酵富集(表2)。

表2 谷物發(fā)酵食品中的GABATable 2 GABA in fermented cereals food

許多富含GABA的食物來自于發(fā)酵谷物。研究發(fā)現(xiàn)，玉米經(jīng)過自然發(fā)酵和乳酸發(fā)酵后其GABA含量上升[42]。在討論大米原料對黃酒中GABA含量影響的研究中發(fā)現(xiàn)，使用3種原料(糯米、精米、秈米)都適合釀制黃酒，但以糯米為原料釀制的黃酒GABA含量最高，達到260.45 mg/L[43]。有研究對大米制作米粉發(fā)酵過程中的GABA含量進行了測定，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過浸泡發(fā)酵后的大米GABA含量最高，含量為96.3 mg/100 g[44]。利用Monascusanka20-2和L.plantarum8014聯(lián)合進行2階段發(fā)酵，生產(chǎn)生物活性紅曲發(fā)酵米，其中活性成分GABA得到有效富集，含量可達到29.9 mg/g[45]。富含GABA的酸面團可以增加面包成品中GABA含量，由乳酸菌發(fā)酵形成的酸面團制成的面包中含有24.2 mg/100 g的GABA[46]。與兩種不同小麥面粉相比，使用特定的乳酸菌制作的全麥面粉中GABA的含量顯著提高[47]。另一項研究顯示，蕎麥粉、莧菜粉、鷹嘴豆粉和藜麥粉以1∶1∶5.3∶1的質(zhì)量比例發(fā)酵形成的面團中GABA含量為504 mg/kg[48]。以不同菌株對小米進行發(fā)酵，其發(fā)酵后的GABA含量有所差異，隨著發(fā)酵時間的增加利用米曲霉發(fā)酵小米GABA含量顯著提高[49]。以發(fā)芽米為原料發(fā)酵制備高含量GABA米醋的研究中，接種巴氏醋桿菌CICC 7009密閉發(fā)酵8 d成品米醋中GABA的含量為100 mg/L[50]。

綜上所述，以不同谷物為原料進行發(fā)酵產(chǎn)生GABA的含量并不相同，發(fā)酵過程涉及的微生物也并不相同。因此，從谷物發(fā)酵食品中篩選出產(chǎn)GABA的微生物，利用這些微生物生產(chǎn)出更多富含GABA的谷物發(fā)酵食品是非常必要的。

3 結(jié)語

本文論述了GABA的作用機理、代謝途徑、合成方法及生理功能，闡述了谷物發(fā)酵食品中GABA的研究現(xiàn)狀，目前谷物食品中多采用植物富集法生產(chǎn)GABA，但是植物富集法產(chǎn)量低。因此，在谷物發(fā)酵過程中可以利用分子生物技術(shù)篩選出產(chǎn)GABA含量較高的菌株，開發(fā)出更多富含GABA的谷物發(fā)酵產(chǎn)品，這樣既可以增加谷物產(chǎn)品的附加值，又延長了谷物食品的產(chǎn)業(yè)鏈，具有重要的社會意義。