維生素B5對(duì)出芽短梗霉產(chǎn)普魯蘭多糖的影響

張伊凡，陳世偉，郭利飛，鄭又銘，趙廷彬，徐雪天，殷海松，喬長晟,,4,5*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)2(天津慧智百川生物工程有限公司，天津，300457) 3(天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院，天津，300457)4(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨天津市 工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300457)5(天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心，天津，300457)

普魯蘭多糖是一種由酵母樣真菌出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)在深層發(fā)酵中以無定形黏液的形式，需氧狀態(tài)下產(chǎn)生的微生物胞外多糖，它是一種線性葡聚糖，由α-1，4糖苷鍵連接的麥芽三糖重復(fù)單位，經(jīng)α-1，6糖苷鍵聚合而成的直鏈狀多糖[1]。普魯蘭多糖是可食用和可生物降解的，還具有高保濕性能，限制水分遷移等作用[2]，通常用作低熱量食品添加劑、膠囊、黏合劑、增稠劑和延伸劑等。低分子質(zhì)量的多糖由于其在生物組織中的高擴(kuò)散性而比高分子質(zhì)量的多糖更具優(yōu)勢[3]。而高分子質(zhì)量的普魯蘭多糖因其具有較高黏度而有很高的價(jià)值，在食品、制藥和化妝品等行業(yè)的應(yīng)用較廣，因此可將其制成微丸、不透氧膜、藥物膠囊等[4-6]。目前對(duì)普魯蘭多糖的研究還集中在其生產(chǎn)方面，如菌株和發(fā)酵工藝的優(yōu)化，研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞形態(tài)、培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件等因素均能影響普魯蘭多糖生產(chǎn)[7-9]。普魯蘭多糖的產(chǎn)量和分子質(zhì)量是決定聚合物收率和特性的重要參數(shù)[10]。而普魯蘭多糖硬膠囊主要是由平均分子質(zhì)量為1.0×105～2.0×105Da的商業(yè)普魯蘭制造的[4]，因此，在提高產(chǎn)量的同時(shí)進(jìn)行分子質(zhì)量的調(diào)控具有一定的意義。

維生素B5又稱遍多酸或泛酸，是一種水溶性維生素，它是能量代謝所必需的微量營養(yǎng)素，且是合成輔酶A和?；d體蛋白的關(guān)鍵前體，輔酶A對(duì)脂肪酸代謝和檸檬酸循環(huán)至關(guān)重要[11]。EDWARDS等[12]在酵母發(fā)酵過程中添加了維生素B5從而增加H2S的生成。SLYSHENKOV等[13]在研究人類淋巴母細(xì)胞增加的機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，將泛酸用于人淋巴母細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)會(huì)大大增加谷胱甘肽的含量。

本研究通過在培養(yǎng)基中添加維生素B5，探討其對(duì)普魯蘭多糖的產(chǎn)量和分子質(zhì)量的影響。對(duì)發(fā)酵過程中關(guān)鍵酶活性進(jìn)行測定，并對(duì)發(fā)酵前期(24 h)和后期(84 h)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)鑒定出的差異蛋白進(jìn)行生物學(xué)分析，目的在于了解維生素B5對(duì)普魯蘭合成的影響，為出芽短梗霉合成普魯蘭的機(jī)理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株

出芽短梗霉(Aureobsidiumpullulans)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)：CGMCC NO.7055。

1.1.2 主要試劑

蔗糖、(NH4)2SO4、MgSO4、NaCl、K2HPO4、酵母浸粉、牛肉粉，所有試劑均為國產(chǎn)分析純。

α-淀粉酶活性測定試劑盒(G0510F)、普魯蘭酶活性測定試劑盒(G0578F)、磷酸葡萄糖變位酶試劑盒(G0563F)、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶試劑盒(G0535F)，蘇州格瑞思生物科技有限公司；真菌葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶酶聯(lián)免疫分析試劑盒(JL49526)，上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

08-F25型5 L自動(dòng)發(fā)酵罐，鎮(zhèn)江格瑞生物工程有限公司；TDL-5-A型高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；5977B-7890B氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀，德國安捷倫科技有限公司；LC-20A高效液相色譜系統(tǒng)，日本島津公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖100，酵母浸粉3，(NH4)2SO41，K2HPO42，MgSO4·7H2O 0.4，NaCl 2.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05，以6.0 mol/L HCl及6.0 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值6.0，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖 150，牛肉粉 5，K2HPO47，MgSO4·7H2O 0.4，NaCl 3，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05，以6.0 mol/L HCl及6.0 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值6.0，121 ℃滅菌20 min。

其中，實(shí)驗(yàn)組是在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.2 g/L的維生素B5。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

取4 ℃冰箱中保存待用的新鮮斜面于28 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中活化2 h，然后從中挑取1環(huán)孢子接入種子培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min搖床恒溫培養(yǎng)20～22 h，制得種子液。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：以6%體積分?jǐn)?shù)的接種量，將種子液接種至裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，在180 r/min搖床中培養(yǎng)，發(fā)酵前24 h溫度維持在32 ℃，后64 h溫度調(diào)節(jié)為28 ℃。

分批發(fā)酵培養(yǎng)：按照6%體積分?jǐn)?shù)的接種量，將種子液接入到5 L發(fā)酵罐的培養(yǎng)基中，發(fā)酵前24 h溫度維持在32 ℃，后72 h溫度調(diào)節(jié)為28 ℃，罐壓恒定在0.02 MPa，通風(fēng)比為1∶1.25(體積比)，初始pH 6.0，轉(zhuǎn)速400 r/min，培養(yǎng)周期96 h。

1.2.3 指標(biāo)測定

細(xì)胞干重及普魯蘭產(chǎn)量的測定方法參照文獻(xiàn)[14]。參照文獻(xiàn)[15]的方法測定普魯蘭分子質(zhì)量。磷酸葡萄糖變位酶(glucose phosphate mutase，PGM)、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(uridine diphosphate glucose pyrophosphorylase，UGP)、葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(glucosyltransferase，GTF)、α-淀粉酶和普魯蘭酶的活性用試劑盒測定。

1.2.4 出芽短梗霉蛋白質(zhì)組學(xué)

取適量84 h的發(fā)酵液于2.5 mL EP管中，10 000 r/min離心10 min，棄上清液留菌體。然后將菌體用PBS重懸，10 000 r/min下精準(zhǔn)快速離心10 min，此操作重復(fù)3次，最后將菌體用液氮速凍10 min，保存至-80 ℃下備用。取1管樣品液氮研磨，然后加入8 mol/L尿素(50∶1體積比加入蛋白酶抑制劑)超聲2 s,停2 s，共2 min。14 000 r/min離心20 min，取上清液，分裝，留取10 μL定量，其余凍入-80 ℃。

酶解脫鹽及質(zhì)譜色譜條件參照文獻(xiàn)[16]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為3組平行樣品計(jì)算結(jié)果的平均值。Origin 2019b軟件作圖。GO和KEGG的注釋用Uniprot的Yeast注釋數(shù)據(jù)完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 維生素B5對(duì)普魯蘭合成的影響

在搖瓶發(fā)酵條件下，不同濃度維生素B5對(duì)出芽短梗霉細(xì)胞生長和普魯蘭合成的影響如圖1所示。

圖1 不同梯度濃度維生素B5對(duì)普魯蘭發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of different gradient concentrations of vitamin B5 on pullulan fermentation

維生素B5的添加提高了普魯蘭產(chǎn)量和菌體量，降低了黏度和普魯蘭的重均分子質(zhì)量。當(dāng)維生素B5添加量為0.2 g/L時(shí)，普魯蘭產(chǎn)量達(dá)到最大值92.57 g/L，比對(duì)照提高了8.82%，單位菌體產(chǎn)量也從3.34 g/L提高到3.41 g/L；而普魯蘭多糖的重均分子質(zhì)量在此濃度下最低，比對(duì)照降低了50.20%。以上結(jié)果表明，培養(yǎng)基中維生素B5的存在有利于普魯蘭多糖產(chǎn)量的提高，同時(shí)能降低它的重均分子質(zhì)量。

2.2 發(fā)酵罐驗(yàn)證維生素B5對(duì)普魯蘭多糖的影響

在5 L發(fā)酵罐中對(duì)出芽短梗霉進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，檢測了0.2 g/L維生素B5和對(duì)照條件下的菌體量、分子質(zhì)量和普魯蘭多糖合成情況。通過圖2分析可知，0～12 h內(nèi)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的菌體量一致，24 h以后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的菌體量開始出現(xiàn)變化，維生素B5的添加刺激了出芽短梗霉的生長，同時(shí)普魯蘭的產(chǎn)量由對(duì)照組的87.3 g/L提高至實(shí)驗(yàn)組的102 g/L,產(chǎn)量增加了16.8%。單位菌體產(chǎn)量也從5.45 g/L提高到5.9 g/L，在維生素B5存在的情況下，普魯蘭最終重均分子質(zhì)量由對(duì)照組的2.14×102kDa下降到實(shí)驗(yàn)組的1.11×102kDa,降幅為48.2%。分子質(zhì)量在發(fā)酵的早期達(dá)到最大值，隨著發(fā)酵的進(jìn)行逐漸降低，與AN等[17]研究的結(jié)果一致。這可能是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)和發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基中分泌的普魯蘭酶和α-淀粉酶導(dǎo)致了普魯蘭多糖的分子質(zhì)量在生長后期顯著降低[18]。

a-菌體量；b-普魯蘭產(chǎn)量；c-重均分子質(zhì)量圖2 添加維生素B5對(duì)普魯蘭多糖發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of adding vitamin B5 on pullulan fermentation

2.3 普魯蘭多糖生物合成和降解中關(guān)鍵酶的活性

由圖3可知，在出芽短梗霉發(fā)酵產(chǎn)普魯蘭過程中，與空白組相比，實(shí)驗(yàn)組的PGM、UGP和GTF都有所提高，關(guān)鍵酶活性的增強(qiáng)從而使得多糖合成有所加強(qiáng)。

a-磷酸葡萄糖變位酶活性；b-尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性；c-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性；d-α-淀粉酶活性；e-普魯蘭酶活性圖3 普魯蘭多糖生物合成和降解過程中關(guān)鍵酶活性Fig.3 Key enzyme activities in the biosynthesis and degradation of pullulan

而對(duì)于實(shí)驗(yàn)組分子質(zhì)量大幅度的降低，實(shí)驗(yàn)測定了發(fā)酵過程中α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性的變化趨勢，α-淀粉酶隨著發(fā)酵的進(jìn)行活性也在增大，實(shí)驗(yàn)組任意時(shí)間點(diǎn)的α-淀粉酶活性均大于空白組。發(fā)酵前中期并未檢測到普魯蘭酶活性，可能是由于活性太低或者發(fā)酵前中期沒有普魯蘭酶的合成，在發(fā)酵后期72 h和發(fā)酵末期96 h，實(shí)驗(yàn)組的普魯蘭酶活性均大于空白組。因此可以推斷，實(shí)驗(yàn)組中維生素B5的添加使得重均分子質(zhì)量的降低可能是由于胞內(nèi)α-淀粉酶和普魯蘭酶活性的增強(qiáng)。

2.4 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

2.4.1 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的鑒定及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

按照表達(dá)倍數(shù)變化1.5倍以上的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)蛋白質(zhì)，結(jié)果如表1所示，出芽短梗霉發(fā)酵合成普魯蘭多糖的過程中，前期(24 h)和后期(84 h)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比分別鑒定出差異蛋白387和381種。

表1 差異蛋白質(zhì)定量結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of protein quantification results

2.4.2 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的鑒定及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

采用層次聚類算法對(duì)比較組的差異表達(dá)蛋白質(zhì)分別進(jìn)行聚類分析，如圖4所示。紅色代表上調(diào)蛋白，藍(lán)色代表下調(diào)蛋白，顏色越深表示差異越加明顯。其中主要差異蛋白變化情況如表2所示。

1-對(duì)照組；2-實(shí)驗(yàn)組圖4 全局分析聚類熱圖Fig.4 Global analysis cluster heat map

表2 差異蛋白結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 2 Differential proteins statistics

2.4.3 差異表達(dá)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化分類體系功能富集分析

差異表達(dá)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化分類體系，它從生物學(xué)的3個(gè)方面對(duì)蛋白質(zhì)功能進(jìn)行分類，即細(xì)胞組分、分子功能和生物過程。通過對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)(24和84 h)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組差異蛋白的GO功能富集分析，結(jié)果如圖5所示。

發(fā)酵前期(24 h)差異蛋白GO功能富集分析顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異蛋白主要參與核糖體生物起源、甾醇生物合成的過程、RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄、RNA轉(zhuǎn)錄tRNA和RNA聚合酶的終止等生物過程。富集到的差異蛋白主要定位到出芽短梗霉細(xì)胞膜的組成部分、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核質(zhì)和核糖體等位置。差異蛋白在分子功能上主要體現(xiàn)在Zn2+結(jié)合、蛋白酶活性、RNA聚合酶Ⅰ活性、大核糖體亞基rRNA及核酸結(jié)合。發(fā)酵后期(84 h)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異蛋白所參與的生物過程主要是麥角固醇的生物合成過程、核糖體生物起源、RNA聚合體的轉(zhuǎn)錄、核轉(zhuǎn)錄的mRNA分解代謝過程及組氨酸生物合成的過程。富集到的差異蛋白主要定位到出芽短梗霉細(xì)胞的膜的組成部分、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核糖體等位置上。這與24 h差異蛋白在細(xì)胞組分上的定位一致。差異蛋白在分子功能上主要體現(xiàn)在Zn2+結(jié)合、DNA結(jié)合、RNA聚合酶I活性等。

a-24 h;b-84 h圖5 24 h和84 h差異蛋白GO功能富集分析Fig.5 24 h,84 h differential protein GO terms enrichment analysis

2.4.4 差異表達(dá)蛋白質(zhì)代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析

通過對(duì)鑒定出來的差異蛋白進(jìn)行KEGG功能注釋，將其按照所屬的不同代謝途徑進(jìn)行功能分類。并對(duì)不同途徑中富集到的蛋白數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，按照蛋白統(tǒng)計(jì)數(shù)目排列出前20的代謝通路，統(tǒng)計(jì)注釋結(jié)果如圖6所示。

a-24 h;b-84 h圖6 24 h和84 h差異蛋白KEGG通路富集度分析Fig.6 24 h,84 h differential protein KEGG pathway enrichment analysis

發(fā)酵前期(24 h)差異蛋白參與的代謝通路主要有類固醇生物合成、甘油肌醇代謝、戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互轉(zhuǎn)化、不飽和脂肪酸的生物合成、組氨酸代謝、β-丙氨酸代謝及磷酸肌醇代謝。發(fā)酵后期(84 h)差異蛋白主要涉及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、磷酸肌醇代謝、類固醇生物合成、不飽和脂肪酸的生物合成、果糖和甘露糖代謝、組氨酸代謝、精氨酸生物合成及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工等途徑。由此可見，實(shí)驗(yàn)組中維生素B5的存在，影響了發(fā)酵過程中碳代謝、氨基酸代謝及脂肪酸代謝，這些均可能與普魯蘭多糖產(chǎn)量和重均分子質(zhì)量的變化有關(guān)。

2.4.5 差異蛋白代謝途徑分析

有學(xué)者提出了一種通過蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝圖的基因重要性確定代謝途徑的活性和方向性的方法[19]。因此，根據(jù)篩選出的主要差異蛋白質(zhì)，結(jié)合KEGG通路和關(guān)鍵酶活性的測定分析了差異蛋白對(duì)代謝途徑的影響，同時(shí)結(jié)合LIU等[20-21]的研究并繪制了差異蛋白對(duì)出芽短梗霉代謝途徑影響圖，如圖7所示。

己糖激酶是參與糖酵解、果糖和甘露糖代謝中的酶[22]，同時(shí)也是普魯蘭多糖生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一。在糖酵解中，己糖激酶是參與α-D-葡萄糖轉(zhuǎn)化成α-D-6-磷酸葡萄糖和β-D-葡萄糖轉(zhuǎn)化成β-D-6-磷酸葡萄糖的酶[22]，實(shí)驗(yàn)組中檢測到己糖激酶相關(guān)蛋白表達(dá)量的提高，促使更多的α-D-6-磷酸葡萄糖和β-D-6-磷酸葡萄糖合成，從而加強(qiáng)了普魯蘭的合成過程及三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環(huán)的進(jìn)行。在果糖和甘露糖代謝中，己糖激酶可以促進(jìn)D-甘露糖轉(zhuǎn)化成D-6-磷酸甘露糖，而D-6-磷酸甘露糖又將生成β-D-6-磷酸葡萄糖進(jìn)入普魯蘭多糖合成的主途徑中，因此，己糖激酶表達(dá)量的提高有利于普魯蘭多糖的合成。

圖7 維生素B5引起的差異蛋白對(duì)出芽短梗霉代謝途徑的影響Fig.7 Effect of differential protein caused by vitamin B5 on the metabolic pathway of A.pullulans

在戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互轉(zhuǎn)化途徑中，木糖還原酶表達(dá)量的下降抑制了D-木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇，因此更多的D-木糖向著丙酮酸轉(zhuǎn)換，丙酮酸最終進(jìn)入TCA循環(huán)為發(fā)酵提供大量能量。

天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶是連接氨基酸代謝和碳水化合物代謝的關(guān)鍵代謝酶，并且通過參與天冬氨酸/蘋果酸穿梭將產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)移到線粒體[23]。在丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代謝途徑中，丙氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)量的上調(diào)促使L-丙氨酸轉(zhuǎn)化成丙酮酸，而天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酸合酶表達(dá)量的下調(diào)，抑制草酰乙酸與L-天冬氨酸之間的相互轉(zhuǎn)化及α-酮戊二酸合成谷氨酸。而TCA循環(huán)是許多合成代謝和分解代謝途徑整合的重要紐帶，它被認(rèn)為是能量代謝的核心過程[24]。丙酮酸、草酰乙酸和α-酮戊二酸含量的提高，加強(qiáng)了TCA循環(huán)，從而為出芽短梗霉菌體的生長和普魯蘭多糖的合成提高更多的能量。

在甘氨酸-絲氨酸-蘇氨酸代謝途徑中，蘇氨酸可以轉(zhuǎn)化為甘氨酸，甘氨酸又可以轉(zhuǎn)化為絲氨酸，最后由絲氨酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，蘇氨酸醛縮酶表達(dá)量的提高增強(qiáng)了蘇氨酸轉(zhuǎn)化為甘氨酸途徑，而L-絲氨酸裂解酶表達(dá)量的提高使更多的絲氨酸向著丙酮酸方向進(jìn)行。

在纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解中，纈氨酸進(jìn)入TCA循環(huán)是通過轉(zhuǎn)化為琥珀酰輔酶A，琥珀酰輔酶A會(huì)進(jìn)一步的合成琥珀酸，而琥珀酸是TCA循環(huán)中必不可少的物質(zhì)，醛脫氫酶表達(dá)量的提高加強(qiáng)了纈氨酸的降解，促進(jìn)了琥珀酰輔酶A的生成，使TCA循環(huán)更加高效的進(jìn)行。

在磷酸肌醇代謝中，α-D-6-磷酸葡萄糖是合成肌醇的出發(fā)物質(zhì)，同時(shí)也是普魯蘭多糖合成路徑中的關(guān)鍵物質(zhì)，肌醇磷酸合成酶是α-D-6-磷酸葡萄糖合成肌醇過程中的酶，其表達(dá)量的下降減弱了磷酸肌醇代謝，同時(shí)也保證了α-D-6-磷酸葡萄糖維持在較高的水平參與到普魯蘭多糖的合成途徑中去。

檸檬酸也是TCA循環(huán)中必不可少的物質(zhì)，由草酰乙酸合成檸檬酸的過程中，檸檬酸合酶表達(dá)量的提高及前面分析得到的乙酰輔酶A的增強(qiáng)，可以增大檸檬酸的含量并加速TCA循環(huán)的進(jìn)行。

維生素B5使PGM、UGP、GTF、α-淀粉酶和普魯蘭酶活性的提高，有利于向普魯蘭多糖合成的方向進(jìn)行，最終使其產(chǎn)量提高。而在α-淀粉酶和普魯蘭酶的作用下，高分子質(zhì)量的普魯蘭多糖被分解，從而降低了普魯蘭多糖的分子質(zhì)量。

3 結(jié)論與討論

本研究考察了維生素B5在普魯蘭生物合成中的作用，采用非標(biāo)記定量技術(shù)對(duì)出芽短梗霉進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，0.2 g/L維生素B5顯著提高了普魯蘭多糖的產(chǎn)量和菌體量，同時(shí)顯著降低了它的重均分子質(zhì)量。而添加維生素B5的實(shí)驗(yàn)組PGM、UGP、GTF、α-淀粉酶和普魯蘭酶活性都有所提高。發(fā)酵前期(24 h)共篩選出387個(gè)差異蛋白，包括196個(gè)上調(diào)蛋白和191個(gè)下調(diào)蛋白，發(fā)現(xiàn)后期(84 h)共篩選出381個(gè)差異蛋白，其中包括182個(gè)上調(diào)蛋白和199個(gè)下調(diào)蛋白。通過對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)維生素B5影響了參與發(fā)酵過程中碳代謝、氨基酸代謝及脂肪酸代謝等，最終在提高了普魯蘭產(chǎn)量的同時(shí)降低了普魯蘭的分子質(zhì)量。研究結(jié)果有助于理解維生素B5在普魯蘭生物合成中的作用機(jī)制，同時(shí)也為出芽短梗霉合成普魯蘭的機(jī)理研究提供了參考。