基于UPLC-MS/MS技術(shù)測(cè)定大鼠血漿中的氨甲環(huán)酸

王 雪，楊玉婷，趙立春，廉 潔，趙小峪，高學(xué)旺，高云華,4，張鎖慧,4*

(1. 中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所，北京 100190；2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，廣西 南寧 530200；3. 中國人民公安大學(xué)，北京 100038；4. 中科微針(北京)科技有限公司，北京 102600)

黃褐斑是一種常見的慢性色素沉積性疾病，臨床表現(xiàn)為患者皮膚表面呈對(duì)稱性和不規(guī)則的色素沉著棕褐色斑紋[1-2]，目前確切的黃褐斑發(fā)病機(jī)制尚未明確，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為黃褐斑的病因病機(jī)主要與肝、脾、腎三臟密切相關(guān)[3]。氨甲環(huán)酸(Tranexamic Acid, TA)是一種纖溶酶抑制劑，結(jié)構(gòu)見圖1，其能通過抑制纖維蛋白的溶解發(fā)揮止血功效，常用于預(yù)防和治療出血[4-5]。TA是賴氨酸的合成衍生物，能抑制纖溶酶原激活物(PA)轉(zhuǎn)化為纖溶酶，其機(jī)制是通過與賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)的可逆相互作用競(jìng)爭(zhēng)性從而抑制PA的激活[6]。從1979年Nijosadako發(fā)現(xiàn)TA能淡化黃褐斑開始,TA便作為一種治療黃褐斑的藥物引起人們關(guān)注[7-8]。

分析生物基質(zhì)中氨甲環(huán)酸的方法最常用的為高效液相色譜法[9-10]，但考慮到TA為末端吸收，其結(jié)構(gòu)中不具有發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)，因此常需要衍生化處理以提高檢測(cè)靈敏度，無形中繁瑣化了氨甲環(huán)酸分析程序，并且可能造成較大的分析差異。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法可獲得高效液相色譜法衍生化后的檢測(cè)限，然而所需血漿樣品體積大[11-12]。本工作擬基于色譜技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)用[13]，建立簡(jiǎn)單、快捷、靈敏度高的分析方法用于測(cè)定血漿中TA的含量，并將應(yīng)用于治療黃褐斑的臨床口服TA片劑在大鼠體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究。

圖1 氨甲環(huán)酸結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of tranexamic acid

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

UPLC-Q-Exactive四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用Dionex Ultimate 3000 RS 快速高效液相色譜系統(tǒng)(美國Thermo Fisher公司，配有電噴霧離子源(ESI)及Xcalibur1.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))；AB1040N分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；MS3渦旋振蕩器(德國 IKA公司)；3K15冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司)；超低溫冰箱(中科美菱公司產(chǎn)品)；pH酸度計(jì)(杭州市奧立龍有限公司產(chǎn)品)。

1.2 試劑

氨甲環(huán)酸對(duì)照品(含量：100%，中國食品藥品檢定研究院)；順式-4-氨基環(huán)己烷羧酸(含量：98%，北京伊諾凱公司產(chǎn)品)；微針制劑(中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所生物材料與應(yīng)用技術(shù)中心研制，批號(hào)：20200118)；甲醇(色譜純，百靈威試劑公司)；甲酸銨(色譜級(jí)，上海麥克林試劑公司)；乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；甲酸(質(zhì)譜級(jí)，美國Fisher公司)；超純水(色譜級(jí)，美國 Thermo Fisher 公司產(chǎn)品)。

1.3 動(dòng)物

SPF 級(jí)健康 SD 大鼠，雌性，體質(zhì)量為(250±10) g，購買于北京金牧陽動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.4 LC-MS/MS分析方法

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Nano Hilic柱(150 mm × 2.1 mm，3 μm)；流動(dòng)相： 10 mmol/L甲酸銨(pH 3.8)-乙腈(95∶5，體積比)；流速為0.2 mL/min；柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為2 μL；采集時(shí)間為 2 min；洗針液為50 % 甲醇溶液。

1.4.2質(zhì)譜條件

ESI+離子源，掃描模式為 Targeted-MS2-正離子，檢測(cè)離子對(duì)分別為 TAm/z158.117 4 → 95.085 9，內(nèi)標(biāo)物(I.S.)m/z144.101 9 → 81.070 4，其他質(zhì)譜方法相關(guān)參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

1.5 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

精準(zhǔn)稱取 TA 標(biāo)準(zhǔn)品100 mg于100 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容至刻度線，此儲(chǔ)備液的質(zhì)量濃度為1 000 mg/L。再分別精確吸取0.02、0.05、0.15、0.5、1、2、5、7 mL的 TA 儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，加入流動(dòng)相定容至刻度，得2、5、15、50、100、200、500、700 mg/L系列 TA 標(biāo)準(zhǔn)品溶液。將 TA 系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液再分別用大鼠空白血漿稀釋 10 倍，配制成相當(dāng)于 TA 血漿濃度為0.2、0.5、1.5、5、10、20、50、70 mg/L的加標(biāo)血漿工作液。精密吸取100 μL空白血漿，分別向其加10 μL TA 標(biāo)準(zhǔn)溶液5、50和500 mg/L，配制成相當(dāng)于氨甲環(huán)酸血漿濃度為0.5、5和50 mg/L的低、中、高3個(gè)濃度樣品，按“1.6”方法操作得質(zhì)控樣品(quality control， QC)。

稱取10 mg 順式-4-氨基環(huán)己烷羧酸對(duì)照品于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容至刻度；應(yīng)用時(shí)再用流動(dòng)相稀釋上述溶液至25 mg/L，得內(nèi)標(biāo)溶液。

1.6 血漿樣品的處理

精密吸取100 μL加標(biāo)血漿樣品于1.5 mL離心管中，加入質(zhì)量濃度為25 mg/L 的內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，3 500 r/min渦旋30 s，再加入500 μL甲醇，3 500 r/min渦旋1 min，13 000 r/min離心15 min，取上清液2 μL于裝有潔凈內(nèi)襯管的進(jìn)樣瓶中分析測(cè)試。

取空白血漿，加入500 μL甲醇，3 500 r/min渦旋1 min，13 000 r/min高速離心15 min。

1.7 穩(wěn)定性考察

1.7.1 樣品的室溫穩(wěn)定性

平行制備3份質(zhì)控樣品(0.5、5、50 mg/L)，于室溫下放置 12 h 后，按照“1.6”樣品處理方法進(jìn)行處理并依“1.4”法進(jìn)行測(cè)定，主要考察樣品濃度的變化情況，以此評(píng)價(jià)血樣的室溫穩(wěn)定性。

1.7.2 樣品的凍融穩(wěn)定性

平行制備3份質(zhì)控樣品(0.5、5、50 mg/L)，將3 種濃度的質(zhì)控樣品置于-20 ℃低溫冰箱使其充分冷凍，然后再取出至室溫使其融化，重復(fù)3次上述凍融步驟，按照“1.6”樣品處理方法進(jìn)行處理并依“1.4” 法進(jìn)行測(cè)定，主要考察測(cè)定濃度的變化情況，以此評(píng)價(jià)血樣的凍融穩(wěn)定性。

1.7.3 樣品處理后的室溫放置穩(wěn)定性

將低、中、高(0.5、5、50 mg/L)3 種濃度的質(zhì)控樣品按“1.6” 法處理后，將處理后的質(zhì)控樣品轉(zhuǎn)入至潔凈液相進(jìn)樣瓶中，用封口膜依次密封進(jìn)樣瓶瓶口，室溫放置12 h 后進(jìn)樣，以此評(píng)價(jià)提取后血漿樣品于室溫放置后的血樣穩(wěn)定性。

1.8 藥代動(dòng)力學(xué)研究

大鼠于SPF級(jí)動(dòng)物房下適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，根據(jù)TA治療黃褐斑的臨床口服單次給藥劑量按照人與大鼠劑量關(guān)系進(jìn)行換算。使用生理鹽水作為溶媒，配制0.9%的TA溶液，使用灌胃針輸送0.5 mL的0.9%TA溶液至大鼠胃部(平行6只)，給藥開始記錄給藥時(shí)間，每只大鼠在給藥前及給藥后預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)(0.5、1、2、3、4、5、6、10、13、16、24、30 h)對(duì)大鼠用割尾法進(jìn)行尾靜脈采血，每次采血0.4 mL左右，將收集的大鼠血液置于預(yù)先經(jīng)過抗凝處理的肝素管中，4 ℃、 5 000 r/min下離心15 min，取200 μL上層血漿保存于-20 ℃冰箱中。按照 “1.6” 血漿樣品處理法進(jìn)行血樣處理，并行 “1.4” 法進(jìn)行血漿樣品中 TA 的含量測(cè)定。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 血漿樣品處理方法優(yōu)化

本文試驗(yàn)了不同蛋白沉淀劑，包含乙腈[14-15]、甲醇[16-18]、高氯酸[19]，對(duì)TA血漿樣品的提取效率，經(jīng)比較色譜譜圖觀察甲醇作為沉淀劑對(duì)TA的提取效果最佳。本試驗(yàn)也曾嘗試對(duì)甲醇處理后的上清液進(jìn)行吹干后流動(dòng)相復(fù)溶[20]，結(jié)果顯示此前處理方法可極大地提高TA檢測(cè)靈敏度，但極易引起基質(zhì)抑制效應(yīng)過大，故綜合考慮本文選擇甲醇作為最終沉淀劑。本文考察了溶劑效應(yīng)對(duì)峰型的影響，分別試驗(yàn)了水、流動(dòng)相、50%甲醇及50%乙腈水作為溶媒對(duì)TA及內(nèi)標(biāo)物出峰的影響，結(jié)果顯示含鹽流動(dòng)相作為溶媒可促進(jìn)目標(biāo)物的電離，獲得更強(qiáng)的信號(hào)，起到離子增強(qiáng)作用。同時(shí)可以向流動(dòng)相中加入甲酸，提高TA與I.S.的離子化強(qiáng)度，并且可以起到改善峰型的作用。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 特異性

分別配制100 μg/L 的TA溶液與內(nèi)標(biāo)溶液，進(jìn)樣質(zhì)譜，首先用全掃描(Full scan)模式確定兩種化合物的分子離子峰后，再選用 AIF - MS / MS模式優(yōu)化出TA與I.S. 碰撞能量分別為 20、50 eV，繼而確定出了二者的分子離子峰。TA 和 I.S. 的二級(jí)掃描質(zhì)譜圖分別如圖2、圖3所示。其中TA 分子離子峰為m/z158.117 4，以m/z158.117 4為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，圖譜中出現(xiàn)m/z95.080 9；內(nèi)標(biāo)物分子離子峰為m/z144.107 9，以m/z144.107 9為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，圖譜中出現(xiàn)m/z81.070 4。

2.2.2 方法學(xué)專屬性

取大鼠的空白血漿分別配制標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行高效液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜分析，按照“1.6” 的血樣前處理方法及 “1.4” 的LC- MS / MS分析方法進(jìn)行測(cè)定，流動(dòng)相、空白血漿、空白血漿加標(biāo)樣品及實(shí)際血樣的LC- MS / MS提取離子流色譜圖如圖4所示。圖4中A、B、C、D分別為流動(dòng)相、大鼠空白血漿、空白血漿加標(biāo)樣品及給藥后大鼠血漿樣品的提取離子流色譜圖。其中1和2分別是TA 的提取離子流色譜圖和 I.S. 的提取離子流色譜圖。在本分析方法中 TA 和 I.S. 的保留時(shí)間分別為 1.72 min 和 1.70 min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明TA 和 I.S. 的測(cè)定不受血漿中內(nèi)源物質(zhì)干擾，方法的專屬性良好。

圖2 氨甲環(huán)酸分子離子峰Fig.2 Product ion mass spectra of TA

圖3 內(nèi)標(biāo)物分子離子峰Fig.3 Product ion mass spectra of I.S.

圖4 流動(dòng)相(A)、大鼠空白血漿(B)最小定量限(C)和給藥后大鼠血漿樣品(D)的提取離子流色譜圖，1為 TA ，2為I.S.Fig.4 Extracted ion chromatograms of mobile phases(A) blank rat plasma(B) limit of quantification(LOQ)(C) and rat plasma after TA microneedle are applied(D). 1 is for TA and 2 is for I.S.

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

按照 “1.5” 的方法與 “1.6” 的方法分別配制加標(biāo)血漿工作液并處理，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定，以待測(cè)物濃度即血漿中 TA 濃度為橫坐標(biāo)，以待測(cè)物 TA 與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得的直線回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖 5，線性方程為Y= 0.088 2X+ 0.018 8，R2= 0.999 6，TA 的線性范圍為0.2～70 mg/L，定量下限為 0.2 mg/L，在此范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve

2.2.4 精密度考察

取空白血漿，配制 TA 低、中、高3個(gè)濃度(0.5、5、50 mg/L)的質(zhì)量控制樣品，對(duì)每一濃度的5個(gè)樣品進(jìn)行分析，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同批于1 d內(nèi)和連續(xù)2 d測(cè)定，根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品的濃度，再根據(jù)QC濃度結(jié)果與配制的標(biāo)準(zhǔn)濃度作對(duì)照，計(jì)算本法的精密度，結(jié)果見表2。血漿中各濃度樣品的RSD在5.5%以下，表明儀器精密度良好。

表2 精密度考察結(jié)果(n=5)

2.2.5 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

取空白血漿，按 “1.5” 項(xiàng)下方法制備TA低、中、高3個(gè)濃度(0.5、5、50 mg/L)的質(zhì)控樣品，對(duì)每一濃度的樣品進(jìn)行5個(gè)樣本分析，進(jìn)樣2 μL，獲得 TA 相應(yīng)峰面積A1(5次測(cè)定的平均值)。

取低、中、高3個(gè)濃度(0.5、5、50 mg/L)的 TA 系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液(即100 μL流動(dòng)相中加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液與10 μL TA標(biāo)準(zhǔn)品溶液)，對(duì)每一濃度的樣品進(jìn)行5個(gè)樣本分析，進(jìn)樣2 μL，獲得 TA 相應(yīng)峰面積A2(5次測(cè)定的平均值)。

照 “1.6” 法處理血漿樣品，吸取100 μL上清液，加入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液各10 μL，配制TA低、中、高3個(gè)濃度(0.5、5、50 mg/L)的樣品，對(duì)每一濃度的樣品進(jìn)行5個(gè)樣本分析，進(jìn)樣2 μL，獲得 TA 相應(yīng)峰面積A3(5次測(cè)定的平均值)。以A3/A1計(jì)算提取回收率；以A3/A2計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，見表3。結(jié)果可知，TA 的基質(zhì)效應(yīng)在(82.16±15.5)%～(86.47±5.6)%之間，基質(zhì)效應(yīng)不會(huì)影響 TA 的測(cè)定；TA 的提取回收率在(83.90±12.6)%～(110.20±3.3)%之間。

表3 基質(zhì)效應(yīng)及提取回收率結(jié)果(n=5)

2.2.6 穩(wěn)定性考察

照“1.7.2” 法考察低、中、高(0.5、5、50 mg/L)3 種濃度質(zhì)控樣品的室溫穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性以及處置后室溫穩(wěn)定性，其結(jié)果見表4。由表4結(jié)果可知，血漿樣品在經(jīng)室溫放置12 h、-20 ℃反復(fù)凍融3次、處理后室溫放置12 h后，血漿中 TA 測(cè)定濃度占添加濃度的百分率分別在(89.97±2.3)% ～(102.10±1.1)%、(89.03±3.7)% ～(98.19 ± 0.6)%、(81.60 ± 3.3)% ～(101.16 ± 1.5)%之間，RSD值均小于10%，說明在上述3種條件下樣品的穩(wěn)定性良好。

表4 血漿樣品穩(wěn)定性測(cè)試(n=3)

2.3 藥代動(dòng)力學(xué)研究

照“1.8”法采集血漿樣品并進(jìn)行檢測(cè)，以采血時(shí)間為橫坐標(biāo)，以測(cè)得的 TA 血藥濃度為縱坐標(biāo)，使用 Origin 8軟件繪制藥時(shí)曲線，計(jì)算最大血藥濃度(Cmax)、達(dá)峰時(shí)間(tmax)以及根據(jù)梯形法計(jì)算藥時(shí)曲線下面積 AUC。圖6為氨甲環(huán)酸灌胃給藥的藥時(shí)曲線，表5為給藥后的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，在給藥1 h，血漿中TA濃度達(dá)峰值，峰值濃度為(2.52 ± 0.77) mg/L，隨后下降，給藥30 h后，血漿中TA濃度基本已達(dá)檢測(cè)定量限，TA的藥時(shí)曲線下面積AUC為(18.8 ± 10.38) mg·h/L，說明該方法成功應(yīng)用于TA在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究。

圖6 TA經(jīng)大鼠灌胃后的血藥濃度-時(shí)間曲線圖Fig.6 Blood concentration-time graph of TA after gavage in rats

表5 給藥后大鼠血漿TA的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(n=6)

3 結(jié)論

建立了可以用于血漿中TA含量測(cè)定，簡(jiǎn)便快捷、專屬性強(qiáng)的UPLC-MS/MS分析方法，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果顯示該方法穩(wěn)定性、專屬性良好，精密度和提取回收率符合要求，而且該方法比現(xiàn)有的高效液相色譜法精密度更好。分析方法經(jīng)過完整驗(yàn)證后，成功應(yīng)用于TA血漿樣品的分析，并且報(bào)道了用于治療黃褐斑的TA口服制劑在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究，以期為TA治療黃褐斑的臨床應(yīng)用提供一定的參考。