復(fù)方五鳳草液對(duì)創(chuàng)面愈合和巨噬細(xì)胞極化的影響

高璐玨， 黃子慧， 朱思洵， 高敏行， 錢佳燕， 孫佳玥， 陳曉鈺， 余 洋

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210014)

慢性難愈性創(chuàng)面的修復(fù)是臨床上常見(jiàn)的難題，創(chuàng)面通常深達(dá)真皮和皮下組織，且面積較大，病程遷延，是一種長(zhǎng)期消耗性疾病，有很高的致殘率[1]。長(zhǎng)期不愈合的創(chuàng)面甚至?xí)邪┳兊娘L(fēng)險(xiǎn)，造成嚴(yán)重后果。且慢性創(chuàng)面的患者多合并有糖尿病、高血壓病等基礎(chǔ)疾病，手術(shù)治療風(fēng)險(xiǎn)大[2-3]。中醫(yī)藥在創(chuàng)面修復(fù)方面具有獨(dú)特而鮮明的優(yōu)勢(shì)[4-5]。慢性創(chuàng)面屬于中醫(yī)“瘡瘍”范疇，結(jié)合多年的臨床實(shí)踐，提出泄毒生新法，并自創(chuàng)復(fù)方五鳳草液，在對(duì)多種慢性創(chuàng)面臨床治療中效果顯著。在下肢靜脈性、燒傷性、壓力性以及糖尿病創(chuàng)面的4種大鼠模型上得到了驗(yàn)證[6]，對(duì)于復(fù)方五鳳草液具體的作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建巨噬細(xì)胞模型，建立慢性難愈性創(chuàng)面大鼠模型，觀察復(fù)方五鳳草液對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響及與創(chuàng)面愈合之間的關(guān)聯(lián)，探索復(fù)方五鳳草液泄毒生新的機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物 復(fù)方五鳳草液為南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院院內(nèi)制劑。其制備工藝為稱取五鳳草2 000 g、白及240 g、貓爪草400 g，加水浸過(guò)藥面，煎煮3次，每次1 h，合并濾液，濃縮成含生藥量為2 500 mg/mL的溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，于4 ℃冰箱保存。以上藥液均由南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥制劑室提供。

1.2 細(xì)胞株及動(dòng)物 U937人組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。清潔級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g，雄性，由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(蘇)2017-0001，單籠飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，自由飲水、攝食，室溫(22±1)℃。

1.3 試劑 佛波醇PMA、脂多糖LPS購(gòu)自美國(guó)Solarbio公司；干擾素IFN-γ、白介素IL-4、白介素IL-13均購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司；DMSO、MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞培養(yǎng)采用的RPMI 1640、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；anti-mouse CD86、CD206 FITC試劑盒購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；人腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒、人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)ELISA試劑盒均購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司；Arg-1抗體、iNOS抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)山羊抗小鼠IgG(H+L)、SYBRGreen均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器 SpectraMax M3多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司；MIKRO220R高速低溫離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Hettich公司；Nanodrop-one二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司；DK-S24水浴鍋購(gòu)自上海精宏公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；LightCycler 480熒光定量PCR儀購(gòu)自瑞士羅氏公司；Nanodrop1000微量分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek公司；IX53倒置熒光顯微鏡、CKX41組織培養(yǎng)用顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；7S-1水平搖床購(gòu)自海門市其林貝爾有限公司；SFPS-2448高速勻漿機(jī)購(gòu)自杭州博日科技股份有限公司；ELGA超純水儀購(gòu)自英國(guó)Purelab公司；EZ Imager凝膠成像圖像分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.1.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo) U937單核細(xì)胞用含10%FBS 和1%青霉素、鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。建立參與炎癥和免疫應(yīng)答的M0、M1、M2型巨噬細(xì)胞模型，在6孔板中接種U937細(xì)胞，每孔3×105個(gè)細(xì)胞，100 ng/mL PMA誘導(dǎo)24 h，建立未活化型U937-M0細(xì)胞；200 ng/mL LPS及20 ng/mL IFN-γ誘導(dǎo)36 h，得到經(jīng)典活化型U937-M1細(xì)胞；40 ng/mL IL-4及20 ng/mL誘導(dǎo)36 h，得到經(jīng)典活化型U937-M2細(xì)胞。

2.1.2 細(xì)胞活力檢測(cè) 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的U937細(xì)胞，以4×104/mL密度接種于96孔板中，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用PMA誘導(dǎo)得到U937-M0細(xì)胞，分別用1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL復(fù)方五鳳草液處理，對(duì)照組為U937細(xì)胞不加藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加20 μL MTT(5 mg/mL)，4 h后吸棄上清，每孔加150 μL DMSO，待結(jié)晶物完全溶解后，檢測(cè)光密度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.1.3 實(shí)驗(yàn)分組 藥物干預(yù)組根據(jù)MTT結(jié)果進(jìn)行分組，M1細(xì)胞極化干預(yù)分為3組，分別為L(zhǎng)PS及IFN-γ與1.0、1.5、2.0 mg/mL復(fù)方五鳳草液共處理組；M2細(xì)胞極化干預(yù)分為3組，分別為IL-4及IL-13與1.0、1.5、2.0 mg/mL復(fù)方五鳳草液共處理組；設(shè)3組對(duì)照，分別為巨噬細(xì)胞不加藥物組(對(duì)照組)、LPS及IFN-γ誘導(dǎo)組(M1組)、IL-4及IL-13誘導(dǎo)組(M2組)。各組均處理36 h后收集細(xì)胞。

2.1.4 CD86、CD206表達(dá)檢測(cè) 細(xì)胞以2×105/mL密度鋪板，先用PMA處理24 h，再用LPS/IFN-γ或IL-4/IL-13誘導(dǎo)極化。加入不同劑量復(fù)方五鳳草液，作用36 h后，收集細(xì)胞至流式管，染FVS，孵育Fc，根據(jù)樣本數(shù)配置合適體積。加入50 μL含F(xiàn)ITC標(biāo)記的CD86抗體和PE標(biāo)記的CD206抗體Staining Buffer混勻，避光孵育30 min，清洗細(xì)胞，棄上清，200 μL含1%多聚甲醛的Staining Buffer重懸，上機(jī)檢測(cè)。

2.1.5 iNOS、Arg-1表達(dá)檢測(cè) 按“2.1.4”項(xiàng)下方法給藥干預(yù)，收集處理后的細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，放射免疫沉淀法并加入蛋白酶抑制劑裂解提取總蛋白，參照BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白定量，電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育一抗、二抗后，并以ECL顯影，掃描膠片并保存。用Quantity One軟件分析灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算iNOS、Arg-1蛋白的相對(duì)表達(dá)。

2.1.6 細(xì)胞上清液中TNF-α、TGF-β水平檢測(cè) 按“2.1.4”項(xiàng)下方法給藥干預(yù)，收集細(xì)胞上清液后，使用ELISA試劑盒，通過(guò)夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、TGF-β水平。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.1 模型制備 參照趙京禹等[7]全層皮膚缺損法，在此基礎(chǔ)上經(jīng)腹腔注射醋酸氫化可的松注射液。

2.2.2 分組與處理 選取造模成功的大鼠12只，隨機(jī)分為模型組、復(fù)方五鳳草液組，每組6只。模型組，創(chuàng)面采用凡士林常規(guī)換藥處理；復(fù)方五鳳草液組，復(fù)方五鳳草液外用換藥，操作為剪取適當(dāng)棉片，以該液體2 mL浸濕外敷，無(wú)菌紗布包裹固定。造模成功后創(chuàng)面自然暴露1 d，第2天即實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，記作實(shí)驗(yàn)第1天，開(kāi)始進(jìn)行藥物干預(yù)，實(shí)驗(yàn)周期為14 d，每日換藥2次。

2.2.3 樣本采集與處理 分別于第1、3、7、14天換藥時(shí)取創(chuàng)緣與正常組織交界處肉芽組織標(biāo)本，取材完畢后立即保存于-80 ℃冰箱。

2.2.4 創(chuàng)面愈合情況觀察及檢測(cè) 建模后第1、3、7、14天對(duì)小鼠局部創(chuàng)面進(jìn)行拍照，使用Image J軟件統(tǒng)計(jì)傷口面積。腐肉量=(腐肉壞死組織面積/目前創(chuàng)面面積)×100%；肉芽量=(新生肉芽面積/目前創(chuàng)面面積)×100%；創(chuàng)面愈合率=[(原始創(chuàng)面面積-時(shí)相點(diǎn)未愈合面積)/原始創(chuàng)面面積]×100%。

2.2.5 RT-qPCR檢測(cè)組織中iNOS、Arg-1的mRNA表達(dá) 將組織室溫解凍，使用全自動(dòng)組織勻漿機(jī)研磨組織，每次勻漿30 s，間隔2 min，于冰上靜置，直至無(wú)明顯塊狀組織，將研磨后的組織轉(zhuǎn)移至離心管中，4 ℃，2 500×g離心20 min，收集上清液，提取創(chuàng)面組織中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，按照 All-in-oneTM Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)iNOs、Arg-1表達(dá)。引物由美國(guó)Genecopoeia公司設(shè)計(jì)合成。

2.2.6 組織中細(xì)胞因子水平檢測(cè) 收集組織勻漿后的上清液，使用ELISA試劑盒，通過(guò)夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)TNF-α、TGF-β水平。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

3.1.1 M0、M1、M2細(xì)胞模型圖 對(duì)U937單核細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，得到M0、M1、M2細(xì)胞模型，見(jiàn)圖1。懸浮的U937細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)后，向巨噬細(xì)胞分化，可見(jiàn)大量細(xì)胞黏附在培養(yǎng)板底，并有一些細(xì)胞長(zhǎng)出小的突起；LPS及IFN-γ促使M0型巨噬細(xì)胞生成更多的突起，可形成梭形；IL-4及IL-13對(duì)U937巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞的形態(tài)無(wú)明顯影響。

圖1 巨噬細(xì)胞模型圖

3.1.2 復(fù)方五鳳草液對(duì)細(xì)胞活力的影響 與對(duì)照組比較，M1組(M0+LPS/IFN-γ)和M2組(M0+IL-4/IL-13)的細(xì)胞存活率無(wú)明顯變化(P>0.05)；當(dāng)復(fù)方五鳳草液的質(zhì)量濃度達(dá)到2.5 mg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率降低(P<0.05)。故選擇1.0、1.5、2.0 mg/mL作為實(shí)驗(yàn)劑量，見(jiàn)圖2。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 復(fù)方五鳳草液對(duì)巨噬細(xì)胞活力的影響

3.1.3 復(fù)方五鳳草液對(duì)M1和M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志分子表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，LPS和IFN-γ誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化導(dǎo)致M1型標(biāo)志分子iNOS、TNF-α的蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，表明誘導(dǎo)其向M1極化；IL-4和IL-13誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化導(dǎo)致M2型標(biāo)志分子Arg-1、TGF-β的相對(duì)表達(dá)升高(P<0.05)，表明誘導(dǎo)其向M2極化。1.0、1.5、2.0 mg/mL復(fù)方五鳳草液干預(yù)M1巨噬細(xì)胞后，M1型炎性因子的表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)；復(fù)方五鳳草液干預(yù)后的M2型標(biāo)志分子的表達(dá)升高(P<0.05)，且2.0 mg/mL劑量作用最佳，見(jiàn)圖3～4。

3.1.4 復(fù)方五鳳草液對(duì)極化巨噬細(xì)胞表面分化群CD86和CD206的影響 M1細(xì)胞表面分化群CD86的平均熒光強(qiáng)度在對(duì)照組和M2組的水平較低，而M1組的水平較高，且不同質(zhì)量濃度復(fù)方五鳳草液的處理不影響CD86表達(dá)；M2細(xì)胞表面分化群CD206的平均熒光強(qiáng)度在對(duì)照組和M1組的水平較低，而M2組的水平較高，且隨著復(fù)方五鳳草液質(zhì)量濃度的增加，CD206的表達(dá)增強(qiáng)。見(jiàn)圖5～6。

3.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

3.2.1 2組小鼠創(chuàng)面宏觀觀察比較 給藥初期，2組小鼠創(chuàng)面均有膿性分泌物，腐肉附著，肉芽蒼白質(zhì)脆。給藥過(guò)程中，2組膿液量、腐肉量漸減少，創(chuàng)面面積漸縮小。治療第7天，復(fù)方五鳳草液組肉芽鮮紅致密，創(chuàng)面無(wú)滲液、腐肉，創(chuàng)緣再上皮化，傷口愈合趨勢(shì)明顯；而模型組創(chuàng)面仍有少量腐肉，肉芽水腫。第14天，復(fù)方五鳳草液組創(chuàng)面結(jié)痂、愈合；模型組創(chuàng)面肉芽新鮮，無(wú)明顯滲液，創(chuàng)面面積縮小，尚未愈合。復(fù)方五鳳草液組在第7、14天腐去速度、上皮增長(zhǎng)速度、創(chuàng)面愈合速度均優(yōu)于模型組，見(jiàn)圖7。

注：與對(duì)照組比較， *P<0.05；與M2組比較，#P<0.05；與M2+1.0 mg/mL復(fù)方五鳳草液組比較，&P<0.05。圖3 復(fù)方五鳳草液對(duì)活化巨噬細(xì)胞iNOS、Arg-1蛋白表達(dá)的影響

3.2.2 復(fù)方五鳳草液對(duì)創(chuàng)面愈合率、肉芽量及腐肉量的影響 與上一時(shí)間點(diǎn)比較，2組小鼠創(chuàng)面在第7、14天的愈合率和肉芽量均增加，腐肉量減少(P<0.05,P<0.01)。與模型組比較，復(fù)方五鳳草液組小鼠創(chuàng)面的的愈合率和肉芽量在第7、14天均增加，腐肉量減少(P<0.05,P<0.01)，見(jiàn)表1～3。

3.2.3 復(fù)方五鳳草液對(duì)創(chuàng)面組織中相關(guān)因子水平的影響 模型組中M1型炎性因子iNOSmRNA表達(dá)和TNF-α水平在第3、7天升高(P<0.05)，第14天也處于較高水平；M2型標(biāo)志分子Arg-1 mRNA表達(dá)和TGF-β水平在第1、3、7天無(wú)明顯變化(P>0.05)，在第14天時(shí)升高。復(fù)方五鳳草液組中M1型炎性因子iNOSmRNA表達(dá)和TNF-α水平在第3天時(shí)達(dá)到最高，并在第7、14天降低；M2型標(biāo)志分子Arg-1 mRNA表達(dá)和TGF-β水平在第7、14天逐漸升高。與模型組比較，復(fù)方五鳳草液組iNOSmRNA表達(dá)和TNF-α水平在第7、14天降低(P<0.01)；與模型組比較，復(fù)方五鳳草液組Arg-1 mRNA表達(dá)和TGF-β水平在第7、14天升高(P<0.05)，見(jiàn)圖8～9。

注：與對(duì)照組比較， *P<0.05；與M2組比較，#P<0.05；與M2+1.5 mg/mL復(fù)方五鳳草液組比較，&P<0.05。圖4 復(fù)方五鳳草液對(duì)活化巨噬細(xì)胞TNF-α、TGF-β水平的影響

圖5 復(fù)方五鳳草液對(duì)巨噬細(xì)胞M1極化CD86表達(dá)的影響

圖6 復(fù)方五鳳草液對(duì)巨噬細(xì)胞M2極化CD206表達(dá)的影響

圖7 兩組小鼠創(chuàng)面對(duì)比

表1 2組小鼠創(chuàng)面愈合率比較

表2 2組小鼠創(chuàng)面肉芽量比較

表3 2組小鼠創(chuàng)面腐肉量比較

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與前一時(shí)間點(diǎn)比較，△P<0.05，△△P<0.01。圖8 小鼠創(chuàng)面組織中iNOS和Arg-1的mRNA表達(dá)

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與前一時(shí)間點(diǎn)比較，△P<0.05，△△P<0.01。圖9 小鼠創(chuàng)面組織中TNF-α和TGF-β的水平

4 討論

慢性難愈性創(chuàng)面指在單因素或多因素共同作用下導(dǎo)致皮膚缺損、破壞，經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間規(guī)范治療，其解剖及功能未達(dá)到完整狀態(tài)且無(wú)愈合傾向的創(chuàng)面[8]。在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家，糖尿病足、褥瘡及下肢動(dòng)靜脈潰瘍等是中老年人面臨的重要危害之一。隨著我國(guó)老齡化的不斷加重及糖尿病、高血壓等基礎(chǔ)疾病的持續(xù)上升，難愈性創(chuàng)面修復(fù)問(wèn)題亟需解決[9-10]。

中醫(yī)藥在促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)中發(fā)揮著巨大作用。周代有“瘍醫(yī)”的劃分，歷代有“煨膿長(zhǎng)肉”“祛腐生新”“肌平皮長(zhǎng)”等理論[11]。復(fù)方五鳳草液中五鳳草有行水殺蟲(chóng)，祛腐解毒功效[12]；白芨有斂瘡消腫，生肌止血功效[13]；貓爪草有拔膿解毒，活血消腫功效[14]。諸藥合用，使“泄毒”“生新”2者相得益彰，臨床運(yùn)用多年，療效滿意。

在慢性創(chuàng)面修復(fù)中，巨噬細(xì)胞起到重要作用[15]，不同微環(huán)境下巨噬細(xì)胞可極化為M1和M2兩種類型[16]，M1型參與炎癥產(chǎn)生的起始和維持；M2型參與組織修復(fù)。受到信號(hào)激活的巨噬細(xì)胞可存在于M1/M2之間的任一中間階段，且具有較強(qiáng)的可塑性。在慢性難愈性創(chuàng)面中，巨噬細(xì)胞功能和表型轉(zhuǎn)換紊亂，M1/M2極化失衡，出現(xiàn)M1型募集、M2型損耗的混合極化狀態(tài)[17]。M2型巨噬細(xì)胞的活化能有效減輕M1型巨噬細(xì)胞引發(fā)的血管免疫損傷，對(duì)于炎癥反應(yīng)后期的組織損傷具有修復(fù)和重塑作用[18-19]。M1向M2型轉(zhuǎn)換是創(chuàng)面由炎癥反應(yīng)轉(zhuǎn)為修復(fù)性反應(yīng)的關(guān)鍵[20]。M1極化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子和介質(zhì)，導(dǎo)致炎癥[21]，而M2巨噬細(xì)胞支持傷口愈合和炎癥消退[22]。在對(duì)M0誘導(dǎo)過(guò)程中，M1、M2始終處于一種共存的狀態(tài)。在慢性炎癥疾病的不同階段，巨噬細(xì)胞亞型的主導(dǎo)地位在時(shí)間上是動(dòng)態(tài)的[23]。M1型和M2型巨噬細(xì)胞無(wú)法如正常創(chuàng)面進(jìn)行時(shí)過(guò)渡，在臨床中則表現(xiàn)為難愈創(chuàng)面中異常炎癥滯留和新生肉芽組織減少的狀態(tài)[24]。從慢性創(chuàng)面愈合過(guò)程中的巨噬細(xì)胞活化角度[21]，選取M1表型指標(biāo)iNOS、TNF-α以及M2表型指標(biāo)Arg-1、TGF-β進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)復(fù)方五鳳草液可促進(jìn)IL-4+IL-13誘導(dǎo)的M2極化；復(fù)方五鳳草液干預(yù)后期，M2型相關(guān)因子水平升高。提示，復(fù)方五鳳草液可能通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞M1、M2的極化對(duì)慢性難愈性創(chuàng)面發(fā)揮修復(fù)作用。

綜上所述，復(fù)方五鳳草液可能通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞M1型向M2型極化發(fā)揮其泄毒生新效用。