貞芍組分方藥對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征模型大鼠的藥效學(xué)研究

崔艷艷， 孫文君， 史 磊， 莫 梅， 劉崇序， 喬明琦， 王杰瓊,4*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)情志病證研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì),山東 濟(jì)南 250355；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)科研處，山東 濟(jì)南 250355；4.山東中醫(yī)藥大學(xué)情志病證創(chuàng)新中藥研究青年科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì),山東 濟(jì)南 250355；5.山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,山東 濟(jì)南 250355；6.澳門(mén)科技大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，澳門(mén) 999078)

圍絕經(jīng)期綜合征 (menopausal syndrome, MPS) 是指婦女圍絕經(jīng)期前后由于卵巢功能衰退導(dǎo)致激素水平不穩(wěn)定而出現(xiàn)的一系列軀體、心理癥狀[1]。MPS的臨床表現(xiàn)為潮熱、煩躁、健忘、易怒等癥狀。腎虛是MPS發(fā)病根本，為常見(jiàn)癥型，肝疏泄太過(guò)為主要特征[2]，主要表現(xiàn)為潮熱、盜汗、煩躁、月經(jīng)量少等。喬明琦根據(jù)自身多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，自擬白芍和女貞子聯(lián)用法治療MPS，女貞子Fructusligustrilucidi具有滋陰補(bǔ)腎之效；白芍CynanchumotophyllumSchneid能夠養(yǎng)血柔肝，二者配伍，補(bǔ)益腎陰，平肝降逆，對(duì)癥下藥[3]。本實(shí)驗(yàn)采用貞芍組分方藥(女貞子提取物和白芍提取物聯(lián)用)給藥，探究該方藥針對(duì)MPS的藥效學(xué)特征。

1 材料

1.1 動(dòng)物 84只雌性SD大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量150～180 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2017-0006。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，晝夜顛倒，周期為明暗12 h/12 h。

1.2 藥物與試劑 黑順片(黃岡金貴中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào)D8040201)；干姜(安徽三和堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)180101)；白芍提取物(陜西慧科植物開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)HK20181118，含芍藥苷50%)；女貞子提取物(山東中醫(yī)藥大學(xué)提供，含齊墩果酸44.54%)；戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號(hào)J20181139)；坤寶丸(北京同仁堂股份有限公司，批號(hào)Z11020178)。大鼠β-內(nèi)腓肽(β-endorphin，β-EP)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、雌二醇(estradiol，E2)、促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)、促卵泡生成素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，貨號(hào)CSB-E08206r、CSB-E12654r、CSB-E05110r、CSB-E08037r、CSB-E06869r)；大鼠一氧化氮(nitrogen monoxidum，NO)ELISA試劑盒(江蘇科晶生物科技有限公司，貨號(hào)YX-141500R)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；qPCR mix[依科賽生物科技(太倉(cāng))有限公司]；蘇木精(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)041M0014V)；伊紅(上海邁坤化工有限公司，批號(hào)20120831)；BCA試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)PC0020)。

1.3 儀器 動(dòng)物行為學(xué)分析系統(tǒng)、XR-SuperMaze動(dòng)物行為分析系統(tǒng)、XR-XZ301大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)均購(gòu)自上海欣軟信息科技有限公司。

2 方法

2.1 女貞子和白芍提取物制備及劑量篩選 女貞子提取物由山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室提取、純化[4-5]，女貞子藥材用8倍量60%乙醇提取3.0 h，提取3次；白芍藥材用8倍量30%乙醇提取3.0 h，提取3次，經(jīng)高效液相色譜法測(cè)得女貞子提取物含齊墩果酸44.54%，白芍提取物含芍藥苷50%。前期按照均勻設(shè)計(jì)，以女貞子提取物和白芍提取物為考察因素，以文獻(xiàn)[6]報(bào)道齊墩果酸用量為參考，齊墩果酸從0～125 mg /kg進(jìn)行六級(jí)遞增，分別為0、25、50、75、100、125 mg/kg；按照更舒方中配比，生藥女貞子和白芍配比為1∶1，女貞子含齊墩果酸0.6%，白芍含芍藥苷1.2%，故齊墩果酸和芍藥苷比例為1∶2，芍藥苷從0～250 mg /kg進(jìn)行六級(jí)遞增，分別為0、50、100、150、200、250 mg /kg。按照均勻設(shè)計(jì)表安排各因素及水平，進(jìn)行組方設(shè)計(jì)，得到均勻設(shè)計(jì)方案，見(jiàn)表1。設(shè)溶媒組、模型組、假手術(shù)組、坤寶丸組、戊酸雌二醇組共5個(gè)對(duì)照組，及貞芍組分方藥1、2、3、4、5、6組6個(gè)給藥組，灌胃28 d，以血清中E2水平為指標(biāo)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果并參考文獻(xiàn)[7]確定貞芍組分方藥低劑量組為女貞子提取物112 mg/kg、白芍提取物100 mg/kg，中劑量組為女貞子提取物225 mg/kg、白芍提取物200 mg/kg，高劑量組為女貞子提取物449 mg/kg、白芍提取物400 mg/kg；戊酸雌二醇組劑量為0.1 mg/kg；坤寶丸組劑量為1 mg/kg。采用1 mL甘油濕潤(rùn)藥物，然后用0.5% CMC-Na配成相應(yīng)溶液，每天灌胃2.5 mL，連續(xù)給藥4周，模型組和假手術(shù)組灌胃等容量0.5% CMC-Na溶液。

表1 女貞子提取物和白芍提取物配伍均勻設(shè)計(jì)劑量表(mg/kg)

2.2 MPS大鼠模型制備與分組 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和造模組，造模組大鼠手術(shù)摘除卵巢，7 d后采用陰道電阻法檢測(cè)，剔除不合格大鼠；14 d后，造模組灌胃給予附子干姜溶液(附子、干姜各50 g，加水煎煮至100 mL)，劑量為10 mg/kg，模型組灌胃等容量蒸餾水，連續(xù)7 d[7]，將造模組大鼠隨機(jī)分為模型組、假手術(shù)組、坤寶丸組、戊酸雌二醇組及貞芍組分方藥低、中、高劑量組。

2.3 取材 大鼠斷頭處死，取腹主動(dòng)脈血，低溫離心取血清保存于冰箱；取全腦后迅速剝離下丘腦、垂體，于液氮中速凍后，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存；取子宮，計(jì)算子宮指數(shù)后，一部分固定于4%甲醛，另一部分于液氮中速凍后，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。

2.4 大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)情況記錄 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，每周記錄大鼠體質(zhì)量，并計(jì)算體質(zhì)量增長(zhǎng)量，體質(zhì)量增長(zhǎng)量=給藥后體質(zhì)量-給藥前體質(zhì)量。

2.5 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn) 開(kāi)始實(shí)驗(yàn)時(shí), 將大鼠放置在開(kāi)放臂與閉合臂重合的部位，記錄大鼠5 min內(nèi)進(jìn)入開(kāi)放臂與閉合臂的次數(shù)和時(shí)間，并計(jì)算開(kāi)放臂進(jìn)入次數(shù)百分比和開(kāi)放臂停留時(shí)間百分比。

2.6 ELISA法檢測(cè)血清、下丘腦、垂體激素水平 按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中E2、β-EP、NO水平，下丘腦GnRH水平，垂體LH、FSH水平。

2.7 HE染色檢測(cè)子宮內(nèi)膜病理學(xué) 將子宮于4%甲醛中固定72 h，經(jīng)脫水、浸蠟、包埋、切片、烤片、脫蠟、HE染色、封片后，檢測(cè)其內(nèi)膜層厚度。

2.8 免疫熒光法檢測(cè)大鼠子宮雌激素受體(ER)α、β蛋白表達(dá) 子宮石蠟切片標(biāo)本脫蠟水化，進(jìn)行抗原修復(fù)，加入熒光淬滅劑，沖洗，牛血清封閉30 min，甩去封閉液，加一抗，4 ℃過(guò)夜，加二抗，避光常溫孵育50 min，沖洗，加入DAPI復(fù)染，封片后，顯微鏡下觀察，并以積分光密度值(IOD值)代表蛋白表達(dá)強(qiáng)度。

2.9 RT-qPCR法檢測(cè)子宮組織ERα、ERβmRNA表達(dá) 液氮研磨子宮后，加入Trizol提取總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，cDNA與引物按照條件進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性20 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)，以β-actin作為內(nèi)參，采用2-△△CT法計(jì)目的基因相對(duì)表達(dá)。引物序列分別為β-actin正向5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，反向5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′；ERα正向5′-AGTG GGCATGATGAAAGGCG-3′，反向5′-AGGGCGGGGC TATTCTTCTT-3′；ERβ正向5′-TATCTCCTCCCAGCAGCAGT-3′，反向5′-CTTGTACCCTCGAAGCGTGT-3′。

3 結(jié)果

3.1 均勻設(shè)計(jì)法篩選貞芍組方最佳配比 與溶媒組比較，假手術(shù)組大鼠血清E2水平無(wú)明顯變化(P>0.05)；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清E2水平降低(P<0.05)；與模型組比較，貞芍組分方藥3、5組大鼠血清E2水平均升高(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。圖1 各組大鼠血清E2水平的影響

3.2 貞芍組分方藥對(duì)MPS大鼠體質(zhì)量的影響 給藥4周后，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠體質(zhì)量增加(P<0.01)；與模型組比較，貞芍組分方藥高劑量組大鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)減慢(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 貞芍組分方藥對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

3.3 貞芍組分方藥對(duì)MPS大鼠高架十字迷宮得分的影響 如圖2所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)百分比降低(P<0.05)；與模型組比較，戊酸雌二醇組大鼠進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)百分比增加(P<0.05)，貞芍組分方藥高劑量組進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)百分比及時(shí)間百分比均增加(P<0.05)。

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。圖2 各組大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)得分

3.4 貞芍組分方藥對(duì)MPS大鼠血清E2、β-EP、NO水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中E2、β-EP、NO水平降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，戊酸雌二醇組及貞芍組分方藥中、低劑量組大鼠血清E2水平升高(P<0.05，P<0.01)，貞芍組分方藥高、中劑量組大鼠血清β-EP水平升高(P<0.05)，貞芍組分方藥高、低劑量組大鼠血清NO水平升高(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

3.5 貞芍組分方藥對(duì)MPS大鼠下丘腦、垂體中激素水平的影響 如圖4所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠下丘腦GnRH水平、垂體FSH和LH水平均升高(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，坤寶丸組、戊酸雌二醇組和貞芍組分方藥各劑量組下丘腦GnRH水平、垂體LH水平均降低(P<0.05，P<0.01)，戊酸雌二醇組大鼠腦組織中垂體FSH水平降低(P<0.05)。

3.6 貞芍組分方藥對(duì)MPS大鼠子宮指數(shù)及內(nèi)膜形態(tài)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠子宮可見(jiàn)較明顯萎縮，子宮內(nèi)膜層變薄(P<0.01)，子宮指數(shù)降低(P<0.01)；與模型組比較，戊酸雌二醇組和貞芍組分方藥高劑量組大鼠子宮指數(shù)升高(P<0.05，P<0.01)，子宮內(nèi)膜層厚度無(wú)明顯變化(P>0.05),見(jiàn)圖 5。

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖3 各組大鼠血清E2、β-EP、NO水平

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖4 各組大鼠腦組織中GnRH、FSH、LH水平

注：與假手術(shù)組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖5 各組大鼠子宮形態(tài)(A)、子宮指數(shù)(B)及內(nèi)膜層厚度(C)(HE染色，

3.7 貞芍組分方藥對(duì)MPS大鼠子宮組織ERα、ERβ蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠子宮組織ERα、ERβ蛋白表達(dá)均降低(P<0.01)；與模型組比較，戊酸雌二醇組與貞芍組分方藥高、中劑量組大鼠子宮組織ERα蛋白表達(dá)均升高(P<0.01)，貞芍組分方藥各劑量組ERβ表達(dá)均升高(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)圖6。

注：與假手術(shù)組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖6 各組大鼠子宮ERα、ERβ免疫熒光染色(A、B)及IOD值

3.8 貞芍組分方藥對(duì)MPS大鼠子宮組織ERα、ERβmRNA表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠子宮組織ERαmRNA表達(dá)降低(P<0.01)，ERβmRNA表達(dá)有降低趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與模型組比較，戊酸雌二醇組和貞芍組分方藥高劑量組大鼠子宮組織ERαmRNA表達(dá)升高(P<0.05)，貞芍組分方藥各組大鼠子宮組織ERβmRNA表達(dá)有升高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見(jiàn)圖7。

注：與假手術(shù)組比較,##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05。圖7 各組大鼠子宮組織中ERα、ERβ mRNA表達(dá)

4 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)行為學(xué)和微觀指標(biāo)對(duì)MPS的主要臨床表現(xiàn)及生理病理變化進(jìn)行驗(yàn)證，與模型組比較，貞芍組分方藥給藥后，大鼠的焦慮樣行為得到改善，體質(zhì)量增長(zhǎng)得到控制，從表觀和微觀指標(biāo)可以看出，大鼠的子宮指數(shù)上調(diào)，子宮萎縮得到改善，E2、β-EP、NO水平升高，F(xiàn)SH、LH、GnRH水平降低，貞芍組分方藥可以較好地改善MPS腎虛肝逆證煩躁易怒、子宮退行性病變等臨床表現(xiàn)。根據(jù)均勻設(shè)計(jì)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)貞芍組分方藥3、5組能提高大鼠血清中E2水平，查閱文獻(xiàn)后決定采用3組的劑量為本實(shí)驗(yàn)用低劑量[7]。

圍絕經(jīng)期婦女卵巢早衰，性激素波動(dòng)，下丘腦-垂體-卵巢軸(HPGA)紊亂[8]，導(dǎo)致GnRH、LH、E2分泌異常[9]。圍絕經(jīng)期婦女體內(nèi)雌激素分泌減少,代謝障礙,更易產(chǎn)生肥胖，雌激素具有調(diào)節(jié)脂代謝的作用,MPS婦女肥胖的發(fā)病與雌激素減少相關(guān)[10]。研究表明，女貞子、白芍能升高雌激素水平[11-12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)貞芍組分方藥治療后，各組GnRH、LH水平降低，E2水平升高，體質(zhì)量增長(zhǎng)得到控制。因此，貞芍組分方藥可能具有雌激素樣作用，通過(guò)平衡HPGA發(fā)揮治療效果。

面對(duì)高架十字迷宮的開(kāi)臂和閉臂，動(dòng)物有探究與回避的矛盾行為，進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)百分比和進(jìn)入開(kāi)臂時(shí)間百分比數(shù)值下降時(shí)，動(dòng)物出現(xiàn)焦慮心理[13-14]。白芍具有疏肝解郁的功效，對(duì)焦慮癥有較好的治療效果[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，貞芍組分方藥組大鼠進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)百分比和進(jìn)入開(kāi)臂時(shí)間百分比均升高，證明二者聯(lián)用可改善焦慮情緒。

圍絕經(jīng)期婦女常見(jiàn)子宮萎縮，子宮內(nèi)膜變薄[16]，研究表明，女貞子有改善子宮萎縮的作用效果[17]。與模型組比較，用藥后貞芍組分方藥各劑量組子宮指數(shù)均升高，改善了子宮萎縮及子宮內(nèi)膜變薄情況。

綜上所述，貞芍組分方藥可能具有雌激素樣作用，但是貞芍組分方藥雌激素樣作用及其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。