烏天麻多酚提取工藝的優(yōu)化

羅紫屹， 朱順耀， 周衡樸， 丁美紅， 石森林

(浙江中醫(yī)藥大學藥學院，浙江 杭州 310053)

天麻為常用中藥，來源于蘭科植物天麻GastrodiaelataBl.的干燥塊莖[1]，2020版《中國藥典》記載其性甘、平，歸肝經，具有息風止痙、平抑肝陽、祛風通絡等功效，可用于治療小兒驚風、癲癇抽搐、破傷風、頭痛眩暈、手足不遂、肢體麻木、風濕痹痛等癥，含有多酚、有機酸、甾醇等成分，具有改善睡眠、抗抑郁、抗癲癇、抗氧化等多種生物活性[2-5]，其中多酚含量最高，占總成分的52%，包括31%酚類、21%檸檬酸酯類[6-7]。由于種質差異，天麻被分為多種變型，如烏天麻、紅天麻、黃天麻、綠天麻，以烏天麻質量最好、價格最高，被稱為天麻中的“黑金”[8]。為了更好發(fā)揮烏天麻質量優(yōu)勢，并為其相關產品的開發(fā)奠定基礎，本實驗采用熵權法結合正交試驗優(yōu)化該藥材提取工藝，以期為相關制劑的開發(fā)提供參考資料。

1 材料

1.1 儀器 H-Class超高效液相色譜儀(美國Waters 公司)；XS105分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；Avanti J-26XP系列高效離心機[貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司]；JA2003N電子天平(上海精密儀器有限公司)； KQ-300DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 天麻素(批號PS0120103)、巴利森苷A(批號PS011140)、巴利森苷B(批號PS011138)、巴利森苷C(批號PS011140)、巴利森苷E(批號PS012053)對照品(成都普思生物科技有限公司)；對羥基苯甲醇對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號111970-201702)。烏天麻購自四川省樂山市金口河區(qū)森寶公司，經浙江中醫(yī)藥大學石森林教授鑒定為烏天麻GastrodiaelataBl. form. Glauca S. Chow的根莖。甲醇、乙腈為色譜純(美國Tedia公司)；磷酸為色譜純[阿拉丁試劑(上海)有限公司]；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 多酚含量測定

2.1.1 供試品溶液制備 將鮮藥材冷凍干燥后打粉，過60目篩，取0.5 g至具塞錐形瓶中，加入一定料液比甲醇，稱定質量，超聲(500 W、40 kHz)處理30 min，放冷，甲醇補足減失的質量，離心，取上清液4 mL至5 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取對照品天麻素2.83 mg、對羥基苯甲醇1.67 mg、巴利森苷A 5.04 mg、巴利森苷B 4.65 mg、巴利森苷C 1.10 mg、巴利森苷E 3.13 mg至25 mL量瓶中，50%甲醇溶解定容至刻度，配制成每1 mL分別含六者0.113 2、0.066 8、0.201 6、0.186 0、0.044、0.125 2 mg的溶液，即得。

2.1.3 色譜條件 ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相乙腈(A)-0.05%磷酸(B)，梯度洗脫(0～5 min，3.0%～10.0%A；5～10 min，10.0%～20.0%A；10～14 min，20.0%～25.0%A；14～14.1 min，25.0%～3.0%A；14.1～16 min，3.0%A)；體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長220 nm；進樣量1 μL。

2.1.4 專屬性試驗 吸取對照品、供試品溶液及空白溶劑各1 μL，在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，各成分均可達到基線分離，溶劑無干擾，可滿足檢測分析要求。

1.天麻素 2.對羥基苯甲醇 3.巴利森苷E 4.巴利森苷B5.巴利森苷C 6.巴利森苷A圖1 各成分 UPLC色譜圖

2.1.5 線性關系考察 取“2.1.2”項下對照品溶液，逐級稀釋至系列質量濃度，在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系

2.1.6 精密度試驗 取對照品溶液適量，在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定6次，測得天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E峰面積RSD分別為0.37%、0.69%、0.86%、0.68%、0.89%、0.65%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液適量，于0、4、6、8、18、24 h在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定，測得天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E峰面積RSD分別為1.37%、0.69%、0.65%、0.68%、0.89%、0.86%，表明溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.1.8 重復性試驗 取同一批藥材，按“2.1.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定，測得天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 含量RSD 分別為1.45%、1.26%、1.19%、2.24%、1.99%、1.21%，表明該方法重復性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 精密移取各成分含量已知的藥材6份，每份2 mg，精密加入100%水平對照品，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E平均加樣回收率分別為97.70%、96.74%、104.09%、98.77%、99.55%、103.72%，RSD分別為1.80%、1.87%、1.73%、3.46%、1.63%、1.63%。

2.2 單因素試驗 采用回流提取法提取多酚后，以乙醇體積分數(60%、70%、80%、100%)，提取時間(1、2、2.5、3 h)、料液比(1∶8、1∶10、1∶12、1∶16)、提取次數(1、2、3次)為影響因素，純度[(各成分含量/干浸膏質量)×100%]、轉移率[(提取工藝中各成分含量/原藥材中各成分含量)×100%]為評價指標。

2.2.2 料液比篩選 取藥材粉末約5 g，分別按料液比1∶8、1∶12、1∶16、1∶20加入70%乙醇，在80 ℃下回流提取1 h，濾過，提取液蒸干，稱定干浸膏質量，取適量用3%乙腈溶解，置于25 mL量瓶中，12 000 r/min離心15 min，0.22 μm微孔濾膜過濾，在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定，每個水平平行3次，按“2.2.1”項下方法計算綜合評分，結果見圖2。最終，選擇料液比為1∶12。

圖2 料液比對綜合評分的影響

2.2.3 提取溫度篩選 取藥材粉末約5 g，按料液比1∶12加入70%乙醇，分別在65、75、85、95 ℃下回流提取1 h，其余操作同“2.2.2”項，按“2.2.1”項下方法計算綜合評分，結果見圖3。最終，選擇提取溫度為85 ℃。

圖3 提取溫度對綜合評分的影響

2.2.4 提取次數篩選 取藥材粉末約5 g，共9份，按料液比1∶12加入70%乙醇，在85 ℃下分別回流提取1、2、3次，每次1 h，其余操作同“2.2.2”項，按“2.2.1”項下方法計算綜合評分，結果見圖4。最終，選擇提取次數為2次。

圖4 提取次數對綜合評分的影響

2.2.5 提取時間篩選 取藥材粉末約5 g，共12份，按料液比1∶12加入70%乙醇，在85 ℃下分別回流提取1、2、2.5、3 h，其余操作同“2.2.2”項，按“2.2.1”項下方法計算綜合評分，結果見圖5。最終，選擇提取時間為2 h。

2.2.6 乙醇體積分數篩選 取藥材粉末約5 g，共12份，按料液比1∶12分別加入40%、60%、80%、100%乙醇，在85 ℃下回流提取2 h，其余操作同“2.2.2”項，按“2.2.1”項下方法計算綜合評分，結果見圖6。最終，選擇乙醇體積分數為80%。

圖5 提取時間對綜合評分的影響

圖6 乙醇體積分數對綜合評分的影響

2.3 正交試驗 在單因素試驗基礎上，固定提取次數為2次，提取時間為2 h，選擇乙醇體積分數(A)、提取溫度(B)、料液比(C)作為影響因素，“2.2.1”項下綜合評分作為評價指標，取藥材粉末約5 g，共9份，設計3因素3水平正交試驗，因素水平見表2，結果見表3，方差分析見表4。

表2 因素水平

表3 正交試驗結果

表4 方差分析

由表4可知，各因素影響程度依次為B(提取溫度)>C(料液比)>A(乙醇體積分數)，但均無顯著影響(P>0.05)。由表3可知，各水平影響程度依次為A2>A3>A1、B3>B2>B1、C2>C1>C3。最終確定，最優(yōu)工藝為A2B3C3，即乙醇體積分數80%，提取溫度85 ℃，料液比1∶12。

2.4 驗證試驗 按“2.3”項下優(yōu)化工藝進行3批驗證試驗，結果見表5，可知該工藝穩(wěn)定可行。

表5 驗證試驗結果(n=3)

3 討論與結論

本實驗以烏天麻中6種主要多酚類成分(天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A)純度、轉移率為評價指標[9]，采用熵權法確定權重系數，可避免常用分析方法存在主觀因素影響的缺陷[10]，有利于客觀真實地分析正交試驗結果。

巴利森苷類化合物是烏天麻主要酚苷類成分，前期已從該藥材中分離鑒定出三十余種[11-12]，具有改善中樞神經系統(tǒng)病變[13-14]、緩解糖尿病[15-17]等生物活性，故本實驗選擇其不同衍生物作為對照品。在烏天麻多酚含量測定過程中，本實驗對流動相(水、甲醇、乙腈、甲酸水、磷酸水)組成和比例[18]、檢測波長等條件進行了摸索，考慮到該類成分以酸性為主，故選擇耐水相、耐酸性的C18色譜柱，最終獲得穩(wěn)定可靠的“2.1.3”項下色譜條件。

綜上所述，烏天麻多酚最優(yōu)提取工藝為按1∶12料液比加入80%乙醇，85 ℃水浴回流提取2次，每次2 h，綜合評分為64.66分，該方法簡便經濟，穩(wěn)定可行，適合工業(yè)化生產，也可為相關制劑生產及質量控制研究提供指導。