井邊草黃酮類成分及其抗腫瘤活性研究

郭小平， 沈立姿， 郭貽龍

(1.屯昌縣人民醫(yī)院藥劑科，海南 屯昌 571600；2.海南健康管理職業(yè)技術(shù)學(xué)院，海南 澄邁 571900；3.?？谑腥嗣襻t(yī)院急診科，海南 ?？?570208)

井邊草PterismultifidaPoir.又名鳳尾草，屬于鳳尾蕨科鳳尾蕨屬多年生草本植物，廣泛分布于我國各地[1]，具有清熱利濕、抗菌消炎、消腫止痛的功效[2]，中醫(yī)臨床常用其治療癌癥、黃疸、腮腺炎、糖尿病，具有較高的臨床應(yīng)用價值。近年來，報道井邊草所含化學(xué)成分包括黃酮[3-6]、倍半萜[7-9]、二萜[7, 9-11]、木脂素[5, 12]等，以黃酮為主，具有抗腫瘤[12-13]、抗前列腺增生[14-15]、抗氧化[16]等多種生物活性。為了尋找具有抗腫瘤活性的先導(dǎo)化合物，本實驗對鳳尾蕨進行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，利用核磁、質(zhì)譜等方法進行結(jié)構(gòu)解析，共鑒定出14個化合物，包括6個黃酮，4個異黃酮類，3個二氫黃酮，1個二氫黃酮醇，其中化合物11～14為首次從鳳尾蕨屬植物中分離得到，化合物1～6、11～14具有抗腫瘤活性。

1 材料

1.1 儀器與試劑 液相色譜儀(日本島津公司)；Avance-400型核磁共振光譜儀(德國布魯克公司)。COSMOSIL半制備柱(250 mm×10 mm，5 μm)；Sephadex LH-20凝膠(美國GE公司)；正相硅膠(100～200、200～300目，青島海洋化工有限公司)。肝癌細胞HepG2、肺癌細胞A549、乳腺癌細胞MDA-MB-231購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.2 藥材 鳳尾草于2019年9月購自四川成都荷花池中藥材市場，經(jīng)南方科技大學(xué)武志剛博士鑒定為鳳尾蕨科鳳尾蕨屬鳳尾草PterismultifidaPoir.，憑證標本(20190911001)保存于海南健康管理職業(yè)技術(shù)學(xué)院。

2 方法

2.1 提取與分離 取干燥的藥材地上部分3 kg，粉碎后用95%乙醇回流加熱提取3 h，提取液減壓濃縮，得到200 g浸膏，依次經(jīng)石油醚、乙酸乙酯萃取，減壓濃縮得到乙酸乙酯部位95 g，經(jīng)正相硅膠色譜分離，石油醚-乙酸乙酯(1∶0～0∶1)洗脫，共得到5個組分Fr.A～Fr.E。

Fr.B(10 g)經(jīng)硅膠柱，以石油醚-二氯甲烷(1∶0～5∶5)梯度洗脫，共得到7個亞組分Fr.B1～Fr.B7，F(xiàn)r.B4(620 mg)經(jīng)LH-20凝膠色譜，二氯甲烷-甲醇(1∶3)分離，得到4個亞組分Fr.B4.1～Fr.B4.4，F(xiàn)r.B4.1(35 mg)經(jīng)二氯甲烷反復(fù)重結(jié)晶，得到化合物13(10 mg)；Fr.B4.4 (44 mg)經(jīng)甲醇反復(fù)重結(jié)晶，得到化合物12(15 mg)；Fr.B4.3 (190 mg)經(jīng)半制備HPLC，甲醇-水(80∶20)，得到化合物11(25 mg,tR=15 min)、14(9 mg,tR=22 min)。

Fr.C(2 g)經(jīng)LH-20凝膠柱，得到7個亞組分Fr.C1～Fr.C7，F(xiàn)r.C2、Fr.C4經(jīng)半制備HPLC，甲醇-水(75∶25)洗脫，得到化合物6(11 mg,tR=19 min)、7(4 mg,tR=23 min)、8(19 mg,tR=27 min)、9(11 mg,tR=19 min)、10(7 mg,tR=24.5 min)。

Fr.D(15 g)經(jīng)過硅膠柱，得到6個亞組分Fr.D1～Fr.D6，F(xiàn)r.D3 (1 g) 經(jīng)LH-20凝膠柱，石油醚-二氯甲烷-甲醇(1∶1∶2)洗脫，得到化合物1(22 mg)，3(25 mg)、4(9 mg)；Fr.D4(210 mg)經(jīng)半制備HPLC，甲醇-水(46∶54)洗脫，得到化合物2(14 mg，tR=25 min)、5(31 mg，tR=31 min)。

2.2 抗腫瘤活性 參照文獻[17]報道，以紫杉醇為陽性藥，采用MTT法檢測所得化合物對A549、HepG2、MDA-MB-231腫瘤細胞株的細胞活性。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)解析

化合物1：淡黃色無定型粉末(甲醇)，分子式C21H20O11, ESI-MSm/z:449.4[M+H]+。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δH:13.00 (1H, s, 5-OH), 7.45 (1H, d,J=8.52 Hz, H-6′), 7.42 (1H, s, H-2′), 6.90 (1H, d,J=8.18 Hz, H-5′), 6.79 (1H, s，H-8), 6.75 (1H, s, H-6), 6.44 (1H, s, H-3), 5.08 (1H, d,J=7.12 Hz, Glc-1), 3.71 (1H, d,J=10.52 Hz, Glc-5), 3.16～3.51 (5H, overlap, Glc-2,3,4,6);13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δC:181.9 (C-4), 164.5 (C-7), 162.9 (C-2), 161.1 (C-5), 156.9 (C-9), 150.0 (C-4′), 145.8 (C-3′), 121.4 (C-1′), 119.2 (C-6′), 116.0 (C-5′), 113.6 (C-2′), 105.3 (C-3), 103.2 (C-10), 99.9 (Glc-1), 99.5 (C-6), 94.7 (C-8), 77.2 (Glc-4), 76.4 (Glc-3), 73.1 (Glc-2), 69.6 (Glc-5), 60.6 (Glc-6)。與文獻[18]報道一致，鑒定為木犀草苷。

化合物2：黃色無定型粉末(甲醇)，分子式C21H20O10, ESI-MSm/z: 433.4[M+H]+。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δH:12.97 (1H, s, 5-OH), 7.96 (2H, d,J=8.52 Hz, H-2′, 6′), 7.42 (1H, s, H-2′), 6.94 (1H, d,J=8.18 Hz, H-3′, 5′), 6.88 (1H, s, H-8), 6.83 (1H, s, H-6), 6.44 (1H, s, H-3), 5.07 (1H, d,J=7.52 Hz, Glc-1), 3.16～3.71 (6H, overlap, Glc-2, 3, 4, 5, 6);13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δC:182.0 (C-4), 164.2 (C-2), 162.9 (C-7), 161.4 (C-5), 161.1 (C-4′), 156.9 (C-9), 128.6 (C-2′, 6′), 121.0 (C-1′), 116.0 (C-3′, 5′), 105.3 (C-10), 103.1 (C-3), 99.9 (Glc-1), 99.5 (C-6), 94.8 (C-8), 77.2 (Glc-4), 76.4 (Glc-3), 73.1 (Glc-2), 69.6 (Glc-5), 60.6 (Glc-6)。與文獻[19]報道一致，鑒定為大波斯菊苷。

化合物4：淡黃色無定型粉末(甲醇)，分子式C21H20O11, ESI-MSm/z: 471.5[M+Na]+。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δH:12.66 (1H, s, 5-OH), 10.88 (1H, s, 7-OH), 9.72 (1H, s, 4′-OH), 9.35 (1H, s, 3′-OH), 7.29 (1H, d,J=1.88 Hz, H-2′), 7.24 (1H, dd,J=8.23, 1.92 Hz, H-6′), 6.87 (1H, d,J=8.11 Hz, H-5′), 6.39 (1H, d,J=1.93 Hz, H-8), 6.21 (1H, d,J=1.89 Hz, H-6), 5.23 (1H, d,J=1.20 Hz, Rha-1), 3.93 (1H, brs, Rha-2), 3.51 (1H, dd,J=9.69, 3.27 Hz, Rha-3), 3.23 (1H, dd,J=9.74, 6.11 Hz, Rha-4), 3.14 (1H, m, Rha-5), 0.81 (3H, d,J=5.92 Hz, Rha-6);13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δc:177.5 (C-4), 163.9 (C-7), 161.3 (C-5), 157.0 (C-9), 156.7 (C-2), 148.3 (C-4′), 145.1 (C-3′), 133.9 (C-3), 121.4 (C-6′), 121.0 (C-1′), 115.6 (C-5′), 115.4 (C-2′), 105.1 (C-10), 101.8 (Rha-1), 98.9 (C-6), 93.4 (C-8), 71.2 (Rha-4), 70.5 (Rha-3), 70.3 (Rha-2), 70.1 (Rha-5), 17.8 (Rha-6)。與文獻[21]報道一致，鑒定為槲皮苷。

化合物5：黃色晶體(甲醇)，分子式C21H20O11,ESI-MSm/z: 449.3[M+H]+.1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δH:7.97 (2H, d,J=8.9 Hz, H-2′,6′), 6.80 (2H, d,J=8.9 Hz, H-3′,5′), 6.31 (1H, d,J=2.0 Hz, H-8), 6.11 (1H, d,J=2.1 Hz, H-6), 5.17 (1H, d,J=7.4 Hz, H-1″);13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δC:179.4 (C-4), 166.7 (C-7), 163.3 (C-5), 161.6 (C-4′), 159.0 (C-2), 158.6 (C-9), 135.5 (C-3), 132.3 (C-2′,6′), 122.8 (C-1′), 116.1 (C-3′,5′), 105.5 (C-10), 104.2 (C-1″), 100.2 (C-6), 94.9 (C-8), 78.4 (C-5″), 78.1 (C-3″), 75.7 (C-2″), 71.4 (C-4″), 62.7 (C-6″)。與文獻[22]報道一致，鑒定為紫云英苷。

化合物6：黃色針狀晶體(甲醇)，分子式C29H58O4, ESI-MSm/z: 325.2[M+Na]+。1H-NMR (400 MHz, Acetone-d6)δH: 4.05 (1H, dd,J=11.22, 6.28 Hz), 3.82 (1H, d,J=5.50 Hz), 3.54 (2H, dd,J=11.22, 6.28 Hz, H-2), 2.98 (44H, brs, H-4′～25′), 0.88 (3H, m, 26′-Me);13C-NMR (100 MHz, Acetone-d6)δC:173.0 (C-1′), 69.8 (C-2), 65.3 (C-1), 63.0 (C-3), 33.7 (C-2′), 31.7 (C-24′), 29.5, 29.5, 28.4, 28.4 (C-4′～23′), 24.8 (C-3′), 22.4 (C-25′), 13.4 (C-26′)。與前期文獻報道一致，鑒定為槲皮素。

化合物11: 黃色無定形粉末(甲醇), C20H16O5，ESI-MSm/z: 337.2[M+H]+。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δH: 13.37 (1H, s, 5-OH), 9.62(1H, s, 7-OH), 8.35(1H, s, H-2), 7.38 (2H, d,J=8.6 Hz, H-2′, H-6′), 6.82 (2H, d,J=8.6 Hz, H-3′, H-5′), 6.61 (1H, d,J=10.0 Hz, H-3″), 6.48 (1H, s, H-8), 5.80 (1H, d,J=10.0 Hz, H-4″), 1.43 (6H, s, H-5″, H-6″);13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δC:180.4 (C-4), 158.8 (C-7), 157.8 (C-5), 156.7 (C-9), 156.0 (C-4′), 154.2 (C-2), 130.1 (C-2′, 6′), 129.0 (C-3″), 122.4 (C-1′), 121.0 (C-3), 115.1 (C-3′, 5′), 114.7 (C-4″), 105.4 (C-10), 104.7 (C-6), 94.6 (C-8), 78.0 (C-2″), 27.8 (C-5″, 6″)。與文獻[26]報道一致，鑒定為貓尾草異黃酮。

化合物12: 黃色針晶(甲醇), C20H16O5，ESI-MSm/z: 337.2[M+H]+。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δH:12.89 (1H, s, 5-OH), 7.88 (1H, s, H-2), 7.37 (2H, d,J=7.6 Hz, H-2′, H-6′), 6.87 (2H, d,J=7.6 Hz, H-3′, H-5′), 6.68 (1H, d,J=10.0 Hz, H-4″), 6.30 (1H, s, H-6), 5.59 (1H, d,J=10.0 Hz, H-3″), 1.48 (6H, s, CH3-5″, CH3-6″);13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz)δC:181.2 (C-4), 162.4 (C-5), 159.8 (C-7), 156.2 (C-4′), 152.6 (C-2), 152.4 (C-9), 130.5 (C-2′, 6′), 127.6 (C-3″), 123.9 (C-3), 123.1 (C-1′), 115.8 (C-3′, 5′), 114.7 (C-4″), 106.2 (C-10), 101.3 (C-8), 100.5 (C-6), 78.3 (C-2″), 28.4 (C-5″, 6″)。與文獻[27]報道一致，鑒定為derrone。

化合物13: 黃色針晶 (氯仿), C15H10O5，ESI-MSm/z: 293.3[M+Na]+。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δH: 12.95 (1H, s, 5-OH), 10.86 (1H, s, 7-OH), 9.57 (1H, s, 3″-OH), 8.31 (1H, s, H-2), 7.37 (2H, d,J=7.6 Hz, H-2′, H-6′), 6.82 (2H, d,J=7.6 Hz, H-3′, H-5′), 6.38 (1H, d,J=2.1 Hz, H-6), 6.22 (1H, d,J=2.1 Hz, H-8);13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δC:122.3 (C-3), 180.2 (C-4), 166.2 (C-7), 162.0 (C-5), 157.5 (C-9), 157.4 (C-4′), 153.9 (C-2), 130.1 (C-2′, 6′), 121.2 (C-1′), 115.0 (C-3′, 5′), 104.4 (C-10), 98.9 (C-6), 93.6 (C-8)。與文獻[28]報道一致，鑒定為染料木黃酮。

化合物14: 白色無定形粉末(甲醇), C21H20O5，ESI-MSm/z: 353.2[M+H]+。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δH:12.93 (1H, s, 5-OH), 8.32 (1H, s, H-2), 7.36 (1H, dd,J=8.4, 2.3 Hz, H-6′), 7.30 (1H, d,J=2.3 Hz, H-2′), 7.00 (2H, d,J=8.4 Hz, H-5′), 6.39 (1H, d,J=2.1 Hz, H-8), 6.23 (1H, d,J=2.1 Hz, H-6), 5.26 (1H, m, H-2″), 3.81 (3H, s, 4′-OCH3), 3.27 (2H, d,J=7.4 Hz, H-1″), 1.68 (3H, s, 4″-CH3), 1.68 (3H, s, 5″-CH3);13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δC:122.6 (C-3), 180.1 (C-4), 164.2 (C-7), 161.9 (C-5), 157.5 (C-9), 156.8 (C-4′), 154.1 (C-2), 131.5 (C-3″), 129.8 (C-2′), 128.9 (C-3′), 127.7 (C-6′), 122.4 (C-1′), 122.2 (C-2″), 110.5 (C-5′), 104.4 (C-10), 55.4 (4′-OCH3), 98.9 (C-6), 93.6 (C-8), 28.2 (C-1″), 25.4 (C-4″), 17.5 (C-5″)。與文獻[29]報道一致，鑒定為3′-(3-methylbut-2-enyl) biochanin A。

3.2 抗腫瘤活性 化合物1～6、11～14對各腫瘤細胞株均具有抑制作用，見表1。

表1 各化合物抗腫瘤活性

4 討論

本實驗對鳳尾草進行研究，共分離鑒定了14個化合物，包括6個黃酮，4個異黃酮，3個二氫黃酮，1個二氫黃酮醇?？鼓[瘤活性研究結(jié)果表明，黃酮、異黃酮均對HepG2、A549、MDA-MB-231細胞具有一定的抑制活性，而二氫黃酮、二氫黃酮醇均無活性，提示黃酮類化合物C環(huán)碳碳雙鍵的存在可能是該類化合物發(fā)揮相關(guān)活性的關(guān)鍵。