射干苷對銀屑病小鼠中Th17/Treg平衡的影響

裴文濤， 侯 靜

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000)

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，世界發(fā)病率約為2%[1]，我國約為0.5%[2]，臨床分型以尋常型為主，約占90%[3]，主要特征為白色鱗片覆蓋的紅斑斑塊、皮損、瘙癢[4]，病因主要包括遺傳、感染、免疫異常、內(nèi)分泌因素[5]。本病屬于慢性復(fù)發(fā)性疾病，需長期治療，相關(guān)藥物包括甲氨蝶呤、環(huán)孢素A、阿維A、生物制劑、類固醇等[6]，但均存在顯著的骨髓抑制、肝功能異常、代謝紊亂等嚴重不良反應(yīng)，從而限制了其臨床應(yīng)用[5]。因此，挖掘不良反應(yīng)較少的新型藥物對于銀屑病的治療意義深遠。

Th17/Treg平衡在銀屑病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，常作為本病治療靶點[7]。射干麻黃湯可通過下調(diào)Th2/Th17細胞，上調(diào)CD4+FoxP3+Tregs，改善哮喘氣道高反應(yīng)[8]，但對銀屑病的治療作用尚不清楚。射干苷是一種提取自射干的異黃酮類衍生物，具有多種生物活性，對哮喘、扁桃體炎、其他炎癥性疾病均具有較好療效[9]，表現(xiàn)出顯著的抗炎和抗氧化活性[10-12]，本研究將對該成分干預(yù)銀屑病的藥效和分子機制進行探索，以期為挖掘相關(guān)有效藥物提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 50只SPF級雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量(180±10)g，購自蘭州大學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(甘)2018-0002，飼養(yǎng)于SPF及環(huán)境，溫度控制在25 ℃，晝夜周期12 h/12 h，自由飲食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實驗。

1.2 試劑與藥物 5%咪喹莫特乳膏(珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司，批號8020750)；甲氨蝶呤(上海上藥信誼藥廠有限公司，批號036170804)。射干苷對照品(純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司，批號B21608)。HE染色試劑盒、RIPA裂解液、5×上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號分別為G1120、R0010、P1040、P1200、PC0020)；小鼠Th17/Treg檢測試劑盒(美國BD公司，批號560767)；小鼠TNF-α、IL-6、IL-10 ELISA檢測試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號ml002095、ml063159、ml037873)；SP免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號SP9001)；RNAiso plus、Mir-X miRNA qRT-PCR TB Green? Kit、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司，批號分別為9108、638314、RR047A、RR420Q)；JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG、HRP標記的山羊抗鼠IgG(英國Abcam公司，批號分別為ab158096、ab235946、ab32101、ab76315、ab194583、ab7090、ab97040)；鼠抗Bax多克隆抗體(杭州華安生物技術(shù)有限公司，批號ER0907)。

2 方法

2.1 分組與造模 50只小鼠隨機分為正常組、模型組、甲氨蝶呤組及低、高劑量射干苷組，每組10只，脫去2 cm×2 cm背部毛，正常組于脫毛處涂抹凡士林，其余各組涂抹咪喹莫特乳膏，每次10 mg，每天2次，連續(xù)14 d。

2.2 給藥方法 造模成功后，甲氨蝶呤組小鼠灌胃2.5 mg/kg甲氨蝶呤，高、低劑量射干苷組小鼠分別灌胃10、2.5 mg/kg射干苷，正常組、模型組小鼠均灌胃等容量生理鹽水，連續(xù)30 d。

2.3 皮損程度評估 參考文獻[13]報道，于造模第0、3、7、10、14天及干預(yù)第0、5、10、15、20、25、30天對小鼠紅斑、鱗屑、浸潤增厚程度(紅斑向周圍浸潤，皮膚增厚)進行評分，三者總和即為小鼠皮損嚴重程度評分，標準見表1。

表1 皮損程度評分標準

2.4 樣本收集 小鼠皮下注射2.5%戊巴比妥鈉進行麻醉，心臟取血，每組取5只小鼠血液，采用EDTA抗凝管收集，用于外周血Th17、Treg細胞比例的檢測；另取5只小鼠血液，采用普通采血管收集，離心后得血清，用于TNF-α、IL-6、IL-10水平的檢測。采血完成后，頸椎脫臼處死小鼠，取下皮損區(qū)皮膚，分成若干等份，一份置于4%多聚甲醛進行固定，其余液氮中速凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存。

2.5 HE染色觀察皮膚組織病理變化 取4%多聚甲醛固定的小鼠皮膚組織，石蠟包埋、切片，依次進行二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，蘇木素染色5 min，水洗10 min，1%鹽酸乙醇分化30 s，水洗30 s，伊紅染色2 min，水洗后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

2.6 免疫組化法檢測皮膚組織中Bax、Bcl-2和Ki67蛋白表達 取“2.5”項下小鼠皮膚組織切片，脫蠟水化后微波-酸修復(fù)抗原，隨后H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清封閉，一抗4 ℃孵育過夜，生物素標記的二抗室溫孵育2 h，HRP標記的鏈霉素37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素染色，鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察。

2.7 ELISA法檢測血清TNF-α、IL-6、IL-10水平 從-80 ℃冰箱中取出小鼠血清，室溫融化后按照ELISA試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-6、IL-10水平。

2.8 流式細胞術(shù)檢測外周血中Th17/Treg細胞比例 取“2.4”項下小鼠全血，加入紅細胞裂解液，按照小鼠Th17/Treg檢測試劑盒說明書檢測Th17/Treg細胞比例。

2.9 RT-qPCR法檢測皮膚組織中miRNA-204-5p、JAK2、STAT3 mRNA表達 取“2.4”項下保存于-80 ℃的小鼠皮膚組織，加入液氮，置于研缽中充分研碎，采用Trizol法提取總RNA，其中JAK2、STAT3 mRNA表達的檢測按照常規(guī)操作進行，總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后，所得cDNA按照熒光定量PCR試劑盒說明書進行熒光定量PCR反應(yīng)；miRNA-204-5p的檢測按照加尾法進行，2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達。引物序列見表2。

表2 引物序列

2.10 Western blot法檢測皮膚組織中Bax、Bcl-2、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達 取“2.9”項下研碎的小鼠皮膚組織，加入RIPA裂解液(含1 mmol/L PMSF)，轉(zhuǎn)移至勻漿器中，繼續(xù)在冰上充分研磨裂解20 min，轉(zhuǎn)移至EP管中，10 000×g離心15 min，取上清，即得總蛋白，取20 μL蛋白樣本用于BCA試劑盒檢測蛋白濃度，其余樣本加入5×上樣緩沖液，煮沸5 min變性，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗、二抗，ECL發(fā)光液顯影，自動曝光儀曝光，采集圖片，分析灰度值。

3 結(jié)果

3.1 造模及射干苷干預(yù)對銀屑病小鼠皮損程度的影響 如圖1A所示，隨著造模天數(shù)的增加，正常組小鼠皮損程度無明顯變化，均處于正常水平；模型組小鼠皮損程度逐漸增加，至造模結(jié)束后皮膚損傷均已達到相關(guān)要求。如圖1B所示，隨著干預(yù)時間延長，正常組小鼠皮損程度無明顯變化，均處于正常水平；模型組小鼠皮損程度逐漸有略微恢復(fù)趨勢，但直至干預(yù)結(jié)束均處于高損傷狀態(tài)；低、高劑量射干苷組及甲氨蝶呤組均可對銀屑病模型小鼠皮損有治療作用，皮膚損傷逐漸恢復(fù)，治療效果依次為甲氨蝶呤>高劑量射干苷>低劑量射干苷。

3.2 射干苷改善銀屑病小鼠皮膚病理損傷 如圖2所示，正常組小鼠皮膚結(jié)構(gòu)完整，表皮未見角化過度和角化不全，表皮顆粒層清晰，真皮周圍無炎性細胞浸潤；與正常組比較，模型組小鼠表皮層不同程度角化過度，棘層肥厚，真皮層內(nèi)血管擴張充血、新生血管增多、水腫伴炎性細胞浸潤；射干苷干預(yù)后，銀屑病小鼠皮膚組織過度角化或角化不足被校正，角質(zhì)層破損程度減輕，棘層增厚被緩解，真皮內(nèi)新生血管和浸潤的炎癥細胞數(shù)量減少，炎癥反應(yīng)緩解，并呈劑量依賴性；高劑量射干苷組與甲氨蝶呤組的效果幾乎一致。

圖1 造模及射干苷干預(yù)對銀屑病小鼠皮損程度評分的影響Fig.1 Effects of modeling and tectoridin intervention on the scores of skin lesions in mice with psoriasis

圖2 射干苷對銀屑病小鼠皮膚病理損傷的影響(×200)Fig.2 Effects of tectoridin on skin pathological injury in mice with psoriasis(×200)

注：A為Bax、Bcl-2、Ki67蛋白免疫組化染色圖(×200)，B～D分別為Bax、Bcl-2、Ki67蛋白免疫組化灰度值半定量分析。與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖3 射干苷對銀屑病小鼠皮損區(qū)皮膚基底層和棘層細胞增殖的影響Fig.3 Effects of tectoridin on cell proliferation of basal layer and spinous layer in psoriatic skin lesions of

3.3 射干苷對銀屑病小鼠皮損區(qū)皮膚基底層和棘層細胞增殖的影響 如圖3所示，與正常組比較，模型組小鼠皮損區(qū)表皮層細胞Bax表達降低(P<0.01)，Bcl-2、Ki67表達升高(P<0.01)；與模型組比較，甲氨蝶呤組和各劑量射干苷組小鼠皮損區(qū)表皮層細胞Bax表達升高(P<0.01)，Bcl-2、Ki67表達降低(P<0.01)，并呈劑量依賴性。

3.4 射干苷減輕銀屑病小鼠炎癥反應(yīng)

3.4.1 血清TNF-α、IL-6、IL-17A水平 如圖4所示，與正常組比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17A水平均升高(P<0.01)；與模型組比較，甲氨蝶呤組、各劑量射干苷組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17A水平均降低(P<0.01)，并呈劑量依賴性。

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖4 射干苷對銀屑病小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17A水平的影響Fig.4 Effects of tectoridin on serum TNF-α, IL-6 and IL-17A levels in mice with

注：A為流式檢測結(jié)果圖，B～D分別為Treg、Th17、Th17/Treg細胞比例統(tǒng)計圖。與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖5 射干苷對銀屑病小鼠外周血Th17/Treg比例的影響Fig.5 Effects of tectoridin on ratios of Th17/Treg in peripheral blood of mice with psoriasis

3.4.2 外周血Th17/Treg比例 如圖5所示，與正常組比較，模型組小鼠外周血Th17細胞及Th17/Treg比例升高(P<0.01)，Treg細胞比例降低(P<0.01)；與模型組比較，甲氨蝶呤組、各劑量射干苷組小鼠外周血Th17細胞及Th17/Treg比例降低(P<0.01)，Treg細胞比例升高(P<0.01)，并呈劑量依賴性。

3.5 射干苷促進銀屑病小鼠皮膚組織中miRNA-204-5p表達并抑制JAK2/STAT3信號通路的激活

3.5.1miRNA-204-5p、JAK2、STAT3 mRNA表達

如圖6所示，與正常組比較，模型組小鼠皮膚組織中miRNA-204-5p表達降低(P<0.01)，JAK2、STAT3 mRNA表達升高(P<0.01)；與模型組比較，甲氨蝶呤組、各劑量射干苷組小鼠皮膚組織中miRNA-204-5p表達升高(P<0.01)，JAK2、STAT3 mRNA表達降低(P<0.01)，并呈劑量依賴性。

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖6 射干苷對銀屑病小鼠皮膚組織中miRNA-204-5p、JAK2、STAT3 mRNA表達的影響Fig.6 Effects of tectoridin on mRNA expressions of miRNA-204-5p,JAK2 and STAT3 in skin tissues of mice with psoriasis

注：A為蛋白條帶圖，B為蛋白相對表達統(tǒng)計圖。與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖7 射干苷對銀屑病小鼠皮膚組織中JAK2/STAT3通路蛋白表達的影響Fig.7 Effects of tectoridin on protein expressions of JAK2/STAT3 pathway in skin tissues of mice with psoriasis

3.5.2 JAK2/STAT3通路蛋白表達 如圖7所示，與正常組比較，模型組小鼠皮損區(qū)皮膚組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達升高(P<0.01)；與模型組比較，甲氨蝶呤組、各劑量射干苷組小鼠皮損區(qū)皮膚組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達降低(P<0.01)，并呈劑量依賴性。

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn)射干苷可改善銀屑病小鼠的皮損區(qū)皮膚損傷癥狀，抑制皮損區(qū)炎癥，校正紊亂的皮膚結(jié)構(gòu)；可抑制銀屑病小鼠皮損區(qū)生發(fā)層細胞中Ki67及Bcl-2蛋白的高表達，提高Bax蛋白的低表達。Ki67是一種增殖細胞的相關(guān)抗原，可作為細胞增殖的標志物，已有研究發(fā)現(xiàn)在銀屑病皮損區(qū)角質(zhì)層細胞和生發(fā)層細胞中Ki67異常高表達[14-15]，可作為銀屑病表皮細胞增殖的標志物。Bcl-2/Bax比例變化直接影響線粒體膜的通透性，進而決定細胞的凋亡，Bcl-2/Bax比例降低，通透性升高，促進凋亡[16-17]。本研究結(jié)果提示射干苷可抑制生發(fā)層細胞異常增殖，改善生發(fā)層細胞增殖與凋亡之間的平衡，使細胞增殖回歸正常，進而改善銀屑病。

目前，研究發(fā)現(xiàn)在銀屑病中，角質(zhì)形成細胞的增殖異常與其所處免疫微環(huán)境中免疫異常密切相關(guān)[18]，TNF-α、IL-6、IL-17A異常高表達，可激活角質(zhì)形成細胞中與增殖、分化、凋亡以及炎癥反應(yīng)相關(guān)的信號通路[19-22]，而這些通路的激活又進一步促進炎癥因子的釋放以及T淋巴細胞的激活，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致角質(zhì)形成細胞增殖異常，形成銀屑病[18, 23]。本研究發(fā)現(xiàn)射干苷可降低銀屑病小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17A水平，改善銀屑病小鼠皮損區(qū)皮膚免疫微環(huán)境。在銀屑病皮膚中，IL-17A導(dǎo)致角質(zhì)形成細胞增殖能力增強，改變其分化[23]；IL-6和TNF-α表達的升高誘導(dǎo)T細胞向Th17細胞分化，改變Th17/Treg平衡，進一步促進IL-17A的表達[24]。本研究發(fā)現(xiàn)射干苷可降低Th17/Treg比例，抑制銀屑病小鼠皮損區(qū)炎癥反應(yīng)，對銀屑病小鼠具有治療作用。

JAK2/STAT3信號通路在角質(zhì)形成細胞中異常激活，促進相關(guān)炎癥因子的產(chǎn)生，調(diào)控T細胞功能分化[25]；同時CD4+T細胞向Th17細胞分化過程中，IL-6和IL-21通過激活T細胞中JAK2/STAT3信號通路促進該分化過程[20]。本研究發(fā)現(xiàn)射干苷可抑制銀屑病小鼠皮損區(qū)皮膚組織中JAK2和STAT3的表達，同時抑制二者蛋白的磷酸化水平，通過抑制銀屑病中JAK2/STAT3信號通路的異常激活，使炎癥反應(yīng)回歸正常。本課題組前期實驗通過TargetScan軟件發(fā)現(xiàn)miRNA-204-5p可靶向JAK2 mRNA的3′-UTR，形成8mer聚合物，誘導(dǎo)JAK2 mRNA翻譯中止和降解。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)射干苷可促進銀屑病小鼠皮損區(qū)皮膚組織中miRNA-204-5p表達的上調(diào)。

綜上所述，射干苷可提高銀屑病小鼠皮損區(qū)皮膚組織中miRNA-204-5p表達，抑制JAK2/STAT3信號通路的異常活化，減輕炎癥反應(yīng)，進而通過平衡角質(zhì)形成細胞的增殖與凋亡，改善銀屑病小鼠皮膚癥狀。本研究為射干苷在臨床治療銀屑病的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。