女貞子多糖對IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)的作用

張安琪， 鄭福增， 周子朋， 趙晶晶， 袁都戶

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450000；2.河南省中醫(yī)院風(fēng)濕科，河南 鄭州 450000)

骨關(guān)節(jié)炎是全球最普遍的老年常發(fā)的慢性關(guān)節(jié)疾病，發(fā)病率逐年上升，軟骨細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)與其發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[1-2]。中藥治療骨關(guān)節(jié)炎具有獨特優(yōu)勢，可抑制炎癥相關(guān)因子的分泌，改善軟骨基質(zhì)合成及分解代謝失衡，抑制軟骨細(xì)胞凋亡等[3-4]。女貞子含有多糖、黃酮類、三萜類等成分，其中多糖含量最高，具有免疫調(diào)節(jié)和抗氧化的作用[5-6]，其提取物可通過抑制軟骨細(xì)胞肥大干預(yù)大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎疼痛[7]；多糖對脂多糖誘導(dǎo)的大鼠睪丸支持細(xì)胞炎性損傷具有保護(hù)作用[8]，但該成分對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)的影響及機(jī)制尚不明確。

研究表明，非編碼RNA(包括lncRNA、miRNA和circRNA)在軟骨細(xì)胞凋亡及骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中起潛在作用[9]，在原發(fā)性膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的軟骨組織及細(xì)胞中，miR-145呈低表達(dá)[10]，它可通過靶向抑制Bcl2相互作用蛋白3(BNIP3)和調(diào)節(jié)Notch信號通路來減少骨關(guān)節(jié)炎中軟骨細(xì)胞的凋亡[11]。課題組前期發(fā)現(xiàn)，miR-145與circ_0039411有結(jié)合位點，并且沉默circ_0039411可以阻止氧化釹引起的支氣管上皮細(xì)胞炎癥，炎癥反應(yīng)的發(fā)生[12]，但其對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響尚不明確。本實驗旨在研究女貞子多糖對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)的影響，并考察其機(jī)制是否與circ_0039411和miR-145有關(guān)，以期為骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)理及防治研究提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞 人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，購自上海博湖生物科技有限公司。

1.2 試劑與藥物 女貞子多糖(批號20200104)購自四川省維克奇生物科技有限公司。DMEM培養(yǎng)液(批號20190204)購自美國HyClone公司；白細(xì)胞介素-1β(interleukin，IL-1β)(批號20200603)購自上海滬震生物科技有限公司；四甲基偶氮唑鹽比色法(methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT)試劑盒(批號20200509)購自上海彩佑實業(yè)有限公司；凋亡檢測試劑盒(批號20200607)購自北京沃凱生物科技有限公司；總蛋白提取試劑盒(批號20200308)購自武漢純度生物科技有限公司；IL-8、IL-6、IL-10酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)(批號20201002、20200906、20200922)購自上海美軒生物科技有限公司；熒光定量試劑盒(批號20200507)購自日本TaKaRa公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(批號20201019)購自上海澤葉生物科技有限公司。

2 方法

2.1 分組 人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，將其分為對照組、模型組及女貞子多糖低、中、高劑量組，對照組不作任何處理，模型組用50 ng/mL IL-1β處理，女貞子多糖低、中、高劑量組分別用50、200、800 μg/mL女貞子多糖和50 ng/mL IL-1β處理。將circ_0039411干擾表達(dá)質(zhì)粒及陰性對照，miR-145模擬物及陰性對照轉(zhuǎn)染至軟骨細(xì)胞，再用50 ng/mL IL-1β處理，作為si-circ_0039411組、si-NC組、miR-145組、miR-NC組；將circ_0039411過表達(dá)載體質(zhì)粒及miR-145抑制表達(dá)質(zhì)粒染至軟骨細(xì)胞，再用800 μg/mL女貞子多糖和50 ng/mL IL-1β處理，作為女貞子多糖+pcDNA-circ_0039411組、女貞子多糖+anti-miR-145組。

2.2 MTT法檢測軟骨細(xì)胞增殖活性 細(xì)胞按“2.1”項下方法分組培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，采用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處光密度(OD)來表示細(xì)胞相對活力。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞按“2.1”項下方法分組培養(yǎng)48 h，離心收集，PBS漂洗后制成單細(xì)胞懸液，加入500 μL緩沖液，混勻后加入Annexin V-FITC、PI各10 μL，混勻后避光孵育15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平。

2.4 Western blot法檢測細(xì)胞蛋白表達(dá) 細(xì)胞按“2.1”項下方法分組培養(yǎng)48 h，離心收集，提取總蛋白，煮沸變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，90 V 30 min后改成120 V 2 h，濕轉(zhuǎn)法移至PVDF膜上，加入5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，將膜放入含有一抗的雜交袋中，在37 ℃下孵育2 h，將PVDF膜放入含二抗的雜交袋中，室溫孵育2 h，ECL發(fā)光顯影，定影成像后檢測蛋白條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達(dá)。

2.5 ELISA法檢測細(xì)胞上清液IL-8、IL-6、IL-10水平 細(xì)胞按“2.1”項下方法分組培養(yǎng)48 h，離心收集細(xì)胞上清液，按照試劑盒說明操作，檢測細(xì)胞上清液IL-8、IL-6、IL-10水平。

2.6 RT-qPCR法檢測細(xì)胞circ_0039411、miR-145表達(dá) 細(xì)胞按“2.1”項下方法分組培養(yǎng)48 h，離心收集，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)，采用2-△△CT法計算目的基因的相對表達(dá)。引物序列為circ_0039411正向5′-GGCACTTTTCACGTGTCACC-3′，反向5′-GTGAA GGGGAAGACACAGGG-3′；miR-145正向5′-GGATTCCTGGAAATACUGTTCT-3′，反向5′-CTCAA CTGGTGTCGTGGAGTC-3′；內(nèi)參GAPDH正向5′-CCACAGTCCATGCCATCAC-3′，反向5′-CGTTCAG CTCAGGGATGAC-3′；內(nèi)參U6正向5′-CTCGCT TCGGCAGCACA-3′，反向5′-AACGCTTCACGAAT TTGCGT-3′。

2.7 雙熒光素酶報告實驗 構(gòu)建circ_0039411野生型和突變型熒光素酶載體WT-circ_0039411、MUT-circ_0039411，將其分別與miR-NC、miR-145共轉(zhuǎn)染至軟骨細(xì)胞中，按照說明書檢測熒光素酶活性。

3 結(jié)果

3.1 女貞子多糖對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷的影響 由圖1、表1可知，與對照組比較，模型組軟骨細(xì)胞活性降低，細(xì)胞凋亡率升高，Bax蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組比較，女貞子多糖各劑量組軟骨細(xì)胞活性升高，細(xì)胞凋亡率降低，Bax蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高，呈劑量依賴性(P<0.05)。

注：1～5分別為對照組，模型組，女貞子多糖低、中、高劑量組。A為各組細(xì)胞凋亡情況，B為各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。圖1 女貞子多糖對軟骨細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effects of L. lucidum polysaccharide on chondrocyte apoptosis

表1 女貞子多糖對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷的影響

3.2 女貞子多糖對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥因子的影響 由表2可知，與對照組比較，模型組軟骨細(xì)胞中IL-8、IL-6水平升高，IL-10水平降低(P<0.05)；與模型組比較，女貞子多糖各劑量組軟骨細(xì)胞中IL-8、IL-6水平降低，IL-10水平升高，呈劑量依賴性(P<0.05)。

表2 女貞子多糖對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥因子的影響

3.3 女貞子多糖對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中circ_0039411、miR-145表達(dá)的影響 由圖2可知，與對照組比較，模型組軟骨細(xì)胞中circ_0039411表達(dá)升高，miR-145表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組比較，女貞子多糖各劑量組軟骨細(xì)胞中circ_0039411表達(dá)降低，miR-145表達(dá)升高，并呈劑量依賴性(P<0.05)。

注：1～5分別為對照組，模型組，女貞子多糖低、中、高劑量組。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與女貞子多糖低劑量組比較，&P<0.05；與女貞子多糖中劑量組比較，$P<0.05。圖2 各組細(xì)胞中circ_0039411、miR-145的表達(dá)Fig.2 Expressions of cellular circ_0039411 and miR-145 in each

3.4 干擾circ_0039411對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷及炎癥因子的影響 由圖3、表3可知，與模型組比較，si-NC組軟骨細(xì)胞circ_0039411、miR-145表達(dá)，細(xì)胞活性，凋亡率，Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)，IL-8、IL-6、IL-10水平均無明顯變化(P>0.05)；與si-NC組比較，si-circ_0039411組軟骨細(xì)胞circ_0039411表達(dá)降低，miR-145表達(dá)升高，細(xì)胞活性升高，凋亡率降低，Bax蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高，IL-8、IL-6水平降低，IL-10水平升高(P<0.05)。

注：1～3分別為模型組、si-NC組、si-circ_0039411組。A為各組細(xì)胞凋亡情況，B為各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，C～D為circ_0039411、miR-145表達(dá)。與模型組比較，*P<0.05；與si-NC組比較，#P<0.05。圖3 干擾circ_0039411對軟骨細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effects of interference with circ_0039411 on chondrocyte apoptosis

3.5 miR-145對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷及炎癥因子的影響 由圖4、表4可知，與模型組比較，miR-NC組軟骨細(xì)胞miR-145表達(dá)，細(xì)胞活性，凋亡率，Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)，IL-8、IL-6、IL-10水平均無明顯變化(P>0.05)；與miR-NC組比較，miR-145組軟骨細(xì)胞miR-145表達(dá)升高，細(xì)胞活性升高，細(xì)胞凋亡率降低，Bax蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高，IL-8、IL-6水平降低，IL-10水平升高(P<0.05)。

表3 干擾circ_0039411對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷及炎癥因子的影響

注：1～3分別為模型組、miR-NC組、miR-145組。A為各組細(xì)胞凋亡情況，B為各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，C為各組細(xì)胞miR-145表達(dá)。與模型組比較，*P<0.05;與miR-NC組比較，#P<0.05。圖4 miR-145對軟骨細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effects of miR-145 on chondrocyte apoptosis

3.6 circ_0039411和miR-145靶向關(guān)系 由圖5可知，circ_0039411和miR-145互補(bǔ)序列。由表5可知，WT-circ_0039411與miR-145共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞熒光素酶活性降低(P<0.05)，而MUT-circ_0039411與miR-145共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)。

3.7 過表達(dá)circ_0039411或抑制miR-145可逆轉(zhuǎn)女貞子多糖對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷炎癥因子的影響 由圖6、表6可知，與女貞子多糖組比較，女貞子多糖+pcDNA-circ_0039411組和女貞子多糖+anti-miR-145組軟骨細(xì)胞的活性降低，細(xì)胞凋亡率升高，Bax蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，IL-8、IL-6水平升高，IL-10水平降低(P<0.05)。

表4 miR-145對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷及炎癥因子的影響

圖5 circ_0039411和miR-145互補(bǔ)序列Fig.5 Complementary sequence of circ_0039411and miR-145

表5 雙熒光素酶報告基因

4 討論

骨關(guān)節(jié)炎是退行性關(guān)節(jié)疾病，以關(guān)節(jié)軟骨破壞為特征，其中軟骨細(xì)胞凋亡起著關(guān)鍵作用；而炎癥可引起軟骨細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致軟骨破壞[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)中藥可緩解關(guān)節(jié)炎患者病癥，治療骨關(guān)節(jié)炎[15]。研究報道鷹嘴豆素通過抑制含NLR家族Pyrin域蛋白3(NLR family, pyrin domain-containing 3，NLRP3)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可減輕骨關(guān)節(jié)炎[16]；青蒿琥酯可減輕IL-1β誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，并延緩小鼠模型中骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展[17]；女貞葉的甲醇提取物在嚙齒類動物中具有止痛和消炎作用[18]；女貞細(xì)枝中分離出的新的類蛇藥苷具有抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用[19]，而女貞子多糖對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響尚不清楚。本實驗用IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞模擬體外骨關(guān)節(jié)炎，用不同劑量女貞子多糖進(jìn)行處理，結(jié)果顯示，軟骨細(xì)胞活性升高，細(xì)胞凋亡率降低，Bax蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高，IL-8、IL-6水平升高，IL-10水平降低，呈劑量依賴性。IL-8、IL-6是促炎因子，IL-10是抑炎因子，表明女貞子多糖可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。

注：1～4分別為模型組、女貞子多糖組、女貞子多糖+pcDNA-circ_0039411組、女貞子多糖+anti-miR-145組。A為各組細(xì)胞凋亡情況，B為各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，C～D為各組細(xì)胞circ_0039411、miR-145表達(dá)。與模型組比較，*P<0.05；與女貞子多糖組比較，#P<0.05。圖6 過表達(dá)circ_0039411或抑制miR-145對軟骨細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Effects of circ_0039411 overexpression or miR-145 inhibition on chondrocyte apoptosis

表6 過表達(dá)circ_0039411或抑制miR-145對軟骨細(xì)胞損傷炎癥因子的影響

研究報道m(xù)iR-145通過直接抑制絲裂原活化的蛋白激酶激酶4(mitogen-activated protein kinase kinase 4，MKK4)來減輕骨關(guān)節(jié)炎中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)驅(qū)動的軟骨基質(zhì)降解[20]。來自脂肪干細(xì)胞的外泌體通過上調(diào)miR-145促進(jìn)軟骨生成并抑制炎癥[21]。LncRNA MALAT1通過調(diào)控miR-145調(diào)節(jié)人骨關(guān)節(jié)炎中IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞活力和軟骨基質(zhì)降解[22]。本實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-145后軟骨細(xì)胞的活性升高，細(xì)胞凋亡率降低，Bax蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高，IL-8、IL-6水平降低，IL-10水平升高，表明過表達(dá)miR-145可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。此外，本實驗證明circ_0039411靶向調(diào)控miR-145，干擾circ_0039411表達(dá)的作用與過表達(dá)miR-145的作用相同。本實驗還發(fā)現(xiàn)女貞子多糖可提高circ_0039411的表達(dá)，降低miR-145的表達(dá)，而過表達(dá)circ_0039411或抑制miR-145可逆轉(zhuǎn)女貞子多糖對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷的影響。

綜上所述，女貞子多糖可能通過調(diào)節(jié)circ_0039411/miR-145緩解IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)。