Nrf2在黃芩素抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡中的作用

徐由財(cái)， 丁文俊， 陳 思， 陳俊邦， 陳婷芳， 曾科峰， 劉 彬,2*， 張競之,2*

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 廣州 510260；2.廣州醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所，廣東 廣州 510180)

心血管疾病是世界人口死亡的主要原因[1]，在我國發(fā)病率也逐年上升，其中缺血性心臟病是最受關(guān)注的問題之一[2]。氧化應(yīng)激引起的心肌細(xì)胞損傷是缺血性心臟病發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，它可引起動(dòng)脈粥樣硬化、心肌缺血、缺血再灌注損傷等[3]，因此緩解心肌細(xì)胞氧化損傷和凋亡是防治缺血性心臟病的重要策略。

核因子E2相關(guān)因子(nuclear factor E2 related factor, Nrf2)是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[4]，在一般情況下，Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)會(huì)通過泛素化降解來抑制Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性；在氧化應(yīng)激條件下，Keap1的特定半胱氨酸殘基被修飾，失去了泛素化降解Nrf2的能力，使其在細(xì)胞內(nèi)積累并轉(zhuǎn)移入核，誘導(dǎo)血紅素氧合酶1(Heme oxygenase 1，HO-1)、醌氧化還原酶1[NAD(P)H quinone dehydrogenase 1，NQO1]等下游靶基因的表達(dá)。Nrf2信號通路在保護(hù)心肌細(xì)胞方面起著重要作用[5]，其過表達(dá)能使小鼠維持氧化還原穩(wěn)態(tài)，抑制氧化應(yīng)激及心室重構(gòu)[6]。

黃芩素是中藥黃芩中活性最高的黃酮類化合物之一，具有抗氧化、抗炎、抗衰老、抗腫瘤等功效[7-8]，Zhao等[9]發(fā)現(xiàn)，該成分能調(diào)節(jié)Ca2+水平影響蛋白的激活和表達(dá)，改善心功能及抑制細(xì)胞凋亡，但其心肌保護(hù)作用和潛在機(jī)制尚未明確。因此，本研究考察黃芩素抗氧化損傷、抗凋亡的作用及Nrf2信號通路在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物 黃芩素對照品(批號MUST-19101105)購自成都曼思特生物科技有限公司。二甲基亞砜(DMSO，批號RNBK1113)、叔丁基過氧化氫(TBHP，批號BCCB8820)購自美國Sigma公司；胎牛血清(FBS，批號2029091)購自以色列Biological Industrie公司；DMEM培養(yǎng)基(批號8120120)、PBS(批號8120122)、胰蛋白酶(批號2072818)均購自美國Gibco公司；Nrf2抗體(貨號12721)、IgG二抗(貨號7074)購自美國CST公司；HO-1(貨號AF5393)、NQO1(貨號DF6437)、Bcl-2(貨號AF6139)、Bax(貨號AF0120)、β-actin(貨號AF7018)抗體購自美國Affinity公司；SOD試劑盒(批號20201015)、GSH-Px試劑盒(批號20201014)購自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白定量試劑盒(批號UJ292597)購自美國Thermo公司；MTS試劑(批號0000453287)購自美國Promega公司；TUNEL凋亡試劑盒(批號BZ2006024)購自武漢塞維爾生物科技有限公司；ML385抑制劑(批號S879001)購自美國Selleck公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) H9c2細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，用含10% FBS、青霉素 (100 U/mL)、鏈霉素(100 mg/mL)的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，當(dāng)呈80%～90%融合時(shí)以0.25%胰蛋白酶消化傳代，隔日換液，每2～3 d傳代1次。

1.3 分組 本研究采用TBHP構(gòu)造H9c2細(xì)胞氧化損傷模型，探討黃芩素抑制TBHP誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡及氧化損傷時(shí)，分為對照組、模型組和黃芩素2.5、5、10 μmol/L組；探討黃芩素能否直接激活Nrf2通路時(shí)，分為對照組和黃芩素2.5、5、10 μmol/L組；探討ML385能否抑制黃芩素激活Nrf2信號通路時(shí)，分為對照組、模型組、黃芩素組(10 μmol/L黃芩素)、ML385組、黃芩素+ML385組(10 μmol/L黃芩素+20 μmol/L ML385)。

1.4 MTS法檢測細(xì)胞活力 調(diào)整細(xì)胞密度至5×104/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后加入含不同濃度待測藥物的培養(yǎng)基，每孔100 μL，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后造模2 h，棄舊培養(yǎng)基，每孔加入100 μL含MTS的工作液(DMEM∶MTS=5∶1)，37 ℃恒溫箱內(nèi)避光孵育2 h，采用酶標(biāo)儀在490 nm波長處檢測光密度(OD)值，并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.5 分子對接及分子動(dòng)力學(xué) 采用Autodock Vina軟件[10]進(jìn)行分子對接，分析Keap1(PDB ID：6QMC)與黃芩素(PubChem CID: 5281605)之間的結(jié)合相互作用。在分子對接前，去除原始空間結(jié)構(gòu)中的水和配體來制備Nrf2的分子對接模擬蛋白，采用YASARA軟件[11]進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。

1.6 表面等離子共振(SPR) 使用PlexArray HT系統(tǒng)進(jìn)行表面等離子共振篩選以確定黃芩素和Keap1的結(jié)合，將Nrf2蛋白打印在3D傳感芯片上，并通過光穿越反應(yīng)將其固定，為獲得結(jié)合親和力，至少需要設(shè)置3個(gè)不同濃度。通過在25 ℃下以2 μL/s的體積流量流經(jīng)樣品進(jìn)行300 s締合，然后在運(yùn)行緩沖液中進(jìn)行300 s的解離，再以3 μL/s的體積流量運(yùn)行200 s的再生緩沖液，可獲得典型的結(jié)合曲線。

1.7 試劑盒檢測細(xì)胞SOD、GSH-Px活性 將H9c2細(xì)胞以每孔2×105個(gè)的密度接種于6孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞長至80%～90%時(shí)分別給予不同濃度的藥物預(yù)處理12 h，TBHP處理2 h，收集細(xì)胞，超聲裂解，離心后取上清液，按照相關(guān)檢測試劑盒說明書檢測細(xì)胞SOD、GSH-Px活性。

1.8 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡率 按“1.7”項(xiàng)下方法收集細(xì)胞，根據(jù)TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，在熒光顯微鏡下觀察，計(jì)算凋亡率。

1.9 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 按“1.7”項(xiàng)下方法收集細(xì)胞，PBS漂洗后用適量RIPA裂解液裂解15 min，刮取蛋白，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清，BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，加入上樣緩沖液，在100 ℃下加熱10 min，12% SDS-PAGE進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，PBST洗滌3次，每次7 min，加入二抗37 ℃孵育1 h，PBST洗滌3次，每次7 min，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，掃描膜，采用Image J軟件對蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析，以目的蛋白與β-actin比值作為待測目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 黃芩素抑制TBHP誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡 如圖1A所示，在0～600 μmol/L TBHP濃度范圍內(nèi)的細(xì)胞存活率隨著濃度增加逐漸降低(P<0.01)；與對照組比較，在TBHP濃度為200 μmol/L時(shí)，H9c2細(xì)胞存活率約為75%，故后續(xù)選取該濃度誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞氧化損傷。如圖1B所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞存活率降低(P<0.01)；與模型組比較，黃芩素預(yù)處理后細(xì)胞存活率提高并呈劑量依賴性(P<0.01)。如圖1C～1D所示，與對照組比較，模型組H9c2細(xì)胞凋亡率升高(P<0.01)；與模型組比較，黃芩素預(yù)處理后細(xì)胞凋亡率降低(P<0.01)，并呈劑量依賴性。如圖1E～1F所示，與模型組比較，黃芩素2.5 μmol/L組細(xì)胞Bcl-2/Bax比值表達(dá)無明顯變化(P>0.05),而5、10 μmol/L組細(xì)胞Bcl-2/Bax比值表達(dá)升高，并呈劑量依賴性(P<0.01)。

注：與對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。圖1 黃芩素抑制TBHP誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡Fig.1 Inhibitory effects of baicalein on TBHP-induced H9c2 cell apoptosis

2.2 黃芩素抑制TBHP誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激 如圖2所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞上清液SOD、GSH-Px活性降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，黃芩素2.5 μmol/L組細(xì)胞SOD、GSH-Px活性無明顯變化(P>0.05)，5、10 μmol/L組細(xì)胞SOD、GSH-Px活性升高，并呈劑量依賴性 (P<0.01)。

注：A～B分別為SOD、GSH-Px活性。與對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。圖2 黃芩素抑制TBHP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激Fig.2 Inhibitory effects of baicalein on TBHP-induced oxidative stress

2.3 黃芩素與Keap1相互作用的分子模擬 本研究采用分子對接技術(shù)發(fā)現(xiàn)黃芩素能夠與Keap1的Kelch位點(diǎn)結(jié)合，結(jié)合力為-9.0 kcal/mol，其三維結(jié)構(gòu)如圖3A所示，可知黃芩素與Keap1的氨基酸殘基ASN-414、ASN-382、ARG-415、SER-508形成氫鍵結(jié)合。通過分子動(dòng)力學(xué)模擬進(jìn)一步研究了Keap1與黃芩素復(fù)合物的穩(wěn)定性，在0、100 ns時(shí)的表面可視化模型如圖3B所示，可知黃芩素能夠穩(wěn)定的呈現(xiàn)在Keap1結(jié)合位點(diǎn)的中心，直到分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)束。在開始的35 ns內(nèi)，Keap1蛋白的均方根偏差(RSMD)從0.5 ?增加到1.5 ?，并圍繞著1.25 ?波動(dòng)(圖3C，藍(lán)色線)，而黃芩素的RMSD穩(wěn)定在0.5 ?波動(dòng)(圖3C，紅色線)，提示該成分與 Keap1結(jié)合是穩(wěn)定的。

圖3 黃芩素與Keap1相互作用的分子模擬結(jié)果Fig.3 Results for molecular simulation of the interaction between baicalein and Keap1

2.4 黃芩素與Keap1相互作用的表面等離子共振分析 如圖4所示，黃芩素能與Keap1的Kelch位點(diǎn)直接結(jié)合，并且Keap1-黃芩素蛋白復(fù)合物能夠穩(wěn)定存在，并可以劑量依賴性地方式快速結(jié)合Keap1，平衡解離常數(shù)(KD)值為6.54×10-7mol/L，表明該成分對Keap1具有很強(qiáng)的親和力，即與Keap1的Kelch位點(diǎn)結(jié)合較為穩(wěn)定。

圖4 黃芩素與Keap1相互作用的表面等離子共振結(jié)果Fig.4 Results for surface plasmon resonance of the interaction between baicalein and Keap1

2.5 黃芩素激活Nrf2信號通路 如圖5所示，黃芩素能劑量依賴性地上調(diào)H9c2細(xì)胞內(nèi)Nrf2的表達(dá)(P<0.01)；與對照組比較，黃芩素2.5 μmol/L組細(xì)胞HO-1、NQO1蛋白表達(dá)無明顯變化(P>0.05)，5、10 μmol/L組細(xì)胞HO-1、NQO1蛋白表達(dá)升高，并呈劑量依賴性(P<0.01)。

注：A為Nrf2、HO-1、NQO1蛋白條帶圖，B～D分別為Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖。與對照組比較，##P<0.01。圖5 黃芩素激活Nrf2信號通路Fig.5 Activation of Nrf2 signal pathway by baicalein

2.6 ML385抑制黃芩素經(jīng)Nrf2通路對心肌凋亡的保護(hù)作用 如圖6所示，與黃芩素組比較，黃芩素+ML385組細(xì)胞存活率降低(P<0.01)，細(xì)胞凋亡率、Bcl-2/Bax比值升高(P<0.01)，提示ML385能夠抑制黃芩素對心肌的保護(hù)作用。

2.7 ML385抑制黃芩素保護(hù)心肌免受氧化損傷的作用 如圖7所示，與黃芩素組比較，黃芩素+ML385組細(xì)胞SOD、GSH-Px活性降低(P<0.01)，Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)也降低(P<0.01)，說明ML385能夠抑制黃芩素保護(hù)H9c2細(xì)胞免受氧化損傷的作用。

注：A為細(xì)胞存活率，B為細(xì)胞凋亡TUNEL染色，C為細(xì)胞凋亡率，D為Bcl-2、Bax蛋白條帶圖，E為Bcl-2/Bax的相對表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖。與對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01；與黃芩素組比較，△△P<0.01。圖6 ML385抑制黃芩素對心肌的保護(hù)作用Fig.6 Inhibitory effects of ML385 to baicalein’s protection on cardiomyocytes

注：A～B分別為SOD、GSH-Px活性，C為Nrf2、HO-1、NQO1蛋白條帶圖，D～F分別為Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖。與對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與黃芩素組比較，△△P<0.01。圖7 ML385抑制黃芩素的抗氧化作用Fig.7 Inhibitory effects of ML385 on baicalein’s antioxidation

3 討論

缺血性心臟病嚴(yán)重威脅人類生命健康，是人類死亡率及致殘率最高的疾病之一。氧化應(yīng)激是缺血性心臟病的發(fā)病機(jī)制之一，當(dāng)機(jī)體受到某些刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)生成大量活性氧(ROS)與活性氮(RNS)，一方面消耗抗氧化物質(zhì)如SOD、GSH-Px等并生成有害物質(zhì)如丙二醛(MDA)等，另一方面產(chǎn)生大量H2O2，并與金屬離子反應(yīng)生成高活性的羥自由基，引發(fā)細(xì)胞鈣超載、蛋白質(zhì)氧化、脂質(zhì)過氧化，損害細(xì)胞膜完整性及功能，誘發(fā)細(xì)胞凋亡[12-13]。

黃芩素是中藥黃芩的活性成分之一，在抗癌、抗炎、神經(jīng)發(fā)生、心臟保護(hù)等方面均有較好的作用。王家偉等[14]認(rèn)為黃芩素可激活JAK-STAT信號通路對大鼠心肌細(xì)胞缺血再灌注起到保護(hù)作用；Chang等[15]發(fā)現(xiàn)黃芩素能通過Akt-NOS-NO信號通路清除ROS的爆發(fā)，進(jìn)而對缺血再灌注的雞心肌細(xì)胞起保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)黃芩素能提高TBHP誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞活力和SOD、GSH-Px活性，并減少細(xì)胞凋亡，具有良好的心肌保護(hù)作用。

在正常生理?xiàng)l件下，Nrf2基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物半衰期較短，緣于Keap1將Nrf2與E3泛素連接酶連接在一個(gè)復(fù)合物中，促進(jìn)Nrf2蛋白的泛素化并通過26S蛋白酶體降解，這被認(rèn)為是Nrf2負(fù)調(diào)控的典型機(jī)制[5]。Keap1是親電子試劑和ROS的生物傳感器，對細(xì)胞內(nèi)Nrf2的調(diào)節(jié)起重要作用。Keap1主要具有BTB和 Kelch 兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，其中BTB和泛素連接酶結(jié)合，Kelch與Nrf2結(jié)合[16]。由于缺乏Nrf2與Keap1結(jié)合位點(diǎn)的蛋白結(jié)構(gòu)，目前Nrf2激動(dòng)劑的藥物研發(fā)都采用Keap1的Kelch位點(diǎn)虛擬篩選潛在的Nrf2激動(dòng)劑。分子對接發(fā)現(xiàn)黃芩素能與Keap1的Kelch位點(diǎn)結(jié)合，結(jié)合力為-9.0 kcal/mol，并與Keap1的氨基酸殘基形成氫鍵；分子動(dòng)力模擬發(fā)現(xiàn)黃芩素與 Keap1結(jié)合是穩(wěn)定的，SPR發(fā)現(xiàn)黃芩素與Keap1結(jié)合的平衡解離常數(shù)(KD)為6.54×10-7mol/L。這些結(jié)果提示黃芩素能與Keap1的Kelch位點(diǎn)結(jié)合，且這種結(jié)合能穩(wěn)定存在。

本研究結(jié)果顯示，黃芩素升高Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)，由此得出黃芩素可能是通過與Keap1的Kelch位點(diǎn)結(jié)合使Nrf2避免被泛素化降解，使其在細(xì)胞內(nèi)迅速積累，轉(zhuǎn)移入核并誘導(dǎo)下游靶基因的表達(dá)。Nrf2信號通路在心肌保護(hù)方面愈發(fā)受到重視，Jiang等[17]發(fā)現(xiàn)BRG1可上調(diào)Nrf2和HO-1表達(dá)來減輕急性心梗時(shí)心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激；Hu等[18]發(fā)現(xiàn)益氣活血方由Nrf2途徑在心力衰竭時(shí)起到心臟保護(hù)作用，使H9c2細(xì)胞免受OGD/R誘導(dǎo)的凋亡；Cui等[19]發(fā)現(xiàn)蝦青素經(jīng)Nrf2信號通路對小鼠心臟氧化應(yīng)激和赭曲霉毒素A暴露引起的線粒體凋亡起保護(hù)作用。本研究使用Nrf2抑制劑ML385后發(fā)現(xiàn)H9c2細(xì)胞活力和SOD、GSH-Px活性降低，細(xì)胞凋亡增加，說明ML385能抑制黃芩素對TBHP誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。

綜上所述，黃芩素可能通過激活Nrf2信號通路減輕了TBHP誘導(dǎo)H9c2引起的氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮其心肌保護(hù)作用。本研究為黃岑素在臨床的運(yùn)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。