鹿紅方通過調(diào)控自噬流對心肌梗死大鼠心功能障礙的影響

趙丹丹， 瞿惠燕， 楊 濤， 張曉青， 周 華

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203)

心肌梗死是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的心臟疾病之一[1]，發(fā)病后由于心肌細(xì)胞的持續(xù)性喪失及適應(yīng)性的心臟重塑不良，導(dǎo)致心臟功能逐漸惡化，最終可致心力衰竭或死亡[2]。自噬是細(xì)胞的一種分解代謝過程，可在營養(yǎng)剝奪、缺氧、生長因子耗竭等應(yīng)激條件下被激活，其各個(gè)階段的協(xié)調(diào)平衡對及時(shí)清除體內(nèi)受損的蛋白質(zhì)及細(xì)胞器，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)有著重要作用[3-4]。近年來，越來越多證據(jù)表明自噬廣泛參與心梗后心室重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展，并且缺血期間自噬流的受損與心臟的不良重構(gòu)和持續(xù)性的心臟功能障礙密切相關(guān)[5-7]。

鹿紅方是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院周華教授在“心腎同治”的理論基礎(chǔ)上研制而成，具有溫腎強(qiáng)心、活血通絡(luò)的功效,在臨床上應(yīng)用數(shù)十年。課題組前期研究表明，鹿紅方可以有效改善心梗后心衰患者的左室射血分?jǐn)?shù)與中醫(yī)證候積分，提高患者生活質(zhì)量，同時(shí)可抑制心肌梗死大鼠的心肌纖維化與心肌肥厚，改善心肌細(xì)胞的能量代謝等[8-10]。本研究擬復(fù)制心肌梗死大鼠模型，同時(shí)結(jié)合自噬流抑制劑(氯喹)驗(yàn)證鹿紅方的心臟保護(hù)作用與自噬的相關(guān)性，并初步探討其可能的作用機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康雄性SPF級Wistar大鼠60只，體質(zhì)量180～200 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2016-0006，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，倫理審查批準(zhǔn)號PZSHUTCM200821018。實(shí)驗(yàn)按照動(dòng)物研究指南——體內(nèi)實(shí)驗(yàn)報(bào)告指南(ARRIVE)進(jìn)行。

1.2 藥物 鹿紅方(組方藥材鹿角片15 g、紅花9 g、淫羊藿30 g、補(bǔ)骨脂20 g、山萸肉15 g、女貞子30 g、沉香6 g)由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院中藥房提供，總提取物的制備方法為取各自處方量10倍量的藥材置于不銹鋼鍋中，加水浸泡1 h，先武火煮沸后再文火煎煮1 h，濾過，濾液備用；藥渣按上述方法再煎煮1次，合并濾液，減壓濃縮，噴霧干燥，即得，每1 g約含4.08 g生藥。氯喹(貨號C6628)購自美國Sigma公司。

1.3 試劑 Beclin-1、LC3-Ⅱ、LC3B、P62、GAPDH、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(貨號3495、2775、12741、5114、5174、7074)均購自美國Cell Signaling Technology公司；LAMP2、P62抗體(貨號66301-1-lg、66184-1-Ig)均購自美國proteintech公司；HE染液、Masson染液(貨號G1003、G1006)購自武漢賽維爾生物科技有限公司；BCA蛋白定量檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒、RIPA裂解緩沖液、蛋白酶和磷酸酶抑制劑、 ECL發(fā)光顯影液(貨號P0012、P0012AC、P0013C、P1045、P0018AS)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；LDH測定試劑盒(貨號A020-2)購自南京建成生物工程研究所；CK-MB檢測試劑盒(貨號FSEA3390)購自上海復(fù)申生物科技有限公司；異氟烷(貨號S10010533)購自上海玉研科學(xué)有限公司。

1.4 儀器 小動(dòng)物麻醉機(jī)、呼吸機(jī)(上海玉研科學(xué)儀器有限公司，型號ABS-100、SAR-100)；動(dòng)物用心電圖儀(深圳邦健生物醫(yī)療設(shè)備股份有限公司，型號ECG-101G)；全自動(dòng)樣品快速研磨儀(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司，型號JXFSTPRP-24L)；酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司，型號Synergy H1)；彩色多普勒超聲診斷儀(美國GE公司，型號VIVID5)，垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司，型號165-8004)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司，型號4600SF)；透射電子顯微鏡(美國FEI公司，型號Tecnai G2 Spirit BioTWIN)。

2 方法

2.1 建模與分組 60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、鹿紅方組、氯喹組、鹿紅方+氯喹組，每組12只。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠行冠狀動(dòng)脈左前降支(left anterior descending coronary artery, LAD)結(jié)扎術(shù)，術(shù)前禁食12 h，持續(xù)性吸入麻醉，仰臥位固定，氣管插管連接呼吸機(jī)，記錄術(shù)前Ⅱ?qū)?lián)心電圖，剃毛、消毒皮膚后于左胸第3～4肋間靠近胸骨處剪開皮膚，鈍性分離肌肉，逐層打開胸腔，去除心包膜，用6～0號帶針線在左心耳下方2～3 mm處結(jié)扎LAD，結(jié)扎成功后可見結(jié)扎區(qū)室壁心肌立即變白，心電圖Ⅱ?qū)?lián)示ST段呈弓背向上抬高。逐層縫合胸腔、肌肉與皮膚，術(shù)后每天肌肉注射40萬單位的青霉素預(yù)防感染，連續(xù)3 d。假手術(shù)組在LAD處僅穿線不結(jié)扎，其余步驟同前。

2.2 給藥 造模后第2天給藥，按照人與大鼠體表面積法換算給藥劑量，氯喹給藥方法與劑量參照文獻(xiàn)[7,11]報(bào)道，鹿紅方組大鼠每天灌胃鹿紅方浸膏2.76 g/kg，氯喹組大鼠每天腹腔注射氯喹50 mg/kg，鹿紅方+氯喹組大鼠每天灌胃鹿紅方浸膏2.76 g/kg+腹腔注射氯喹50 mg/kg，假手術(shù)組及模型組大鼠灌胃等容量生理鹽水，每天給藥1次，連續(xù)2周。

2.3 超聲心動(dòng)圖檢測 最后1次給藥結(jié)束后，超聲心動(dòng)圖評估大鼠心臟功能，從短軸視圖中獲取二維圖像，檢測左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)、左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening, LVFS)、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular internal dimension diastole, LVIDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular internal dimension systole, LVIDs)。

2.4 心肌組織病理學(xué)分析 大鼠心肌組織用4%多聚甲醛固定24 h后，石蠟包埋，切片5 μm，常規(guī)脫蠟、覆水，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)、馬松(Masson)染色來觀察其病理損傷及纖維化情況，采用Image J軟件分析心肌纖維化的面積。

2.5 心肌損傷標(biāo)志物檢測 大鼠腹主動(dòng)脈采血結(jié)束后室溫下靜置2 h，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清，檢測血清乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme, CK-MB)活性。

2.6 透射電鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 取距大鼠左心室梗死邊緣2 mm處的心肌，2.5%戊二醛固定至少2 h，然后常規(guī)洗滌、固定、包埋，制作超薄切片，醋酸雙氧鈾+檸檬酸鉛雙染色，在透射電子顯微鏡下觀察線粒體、自噬體等超微結(jié)構(gòu)。

2.7 Western blot法檢測心肌組織自噬蛋白的表達(dá) 取大鼠左心室梗死邊緣區(qū)的心肌組織約50 mg，加入裂解液、磷酸酶和蛋白酶抑制劑，組織研磨機(jī)研磨，裂解充分后離心取上清，BCA法檢測蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%的脫脂牛奶封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，回收一抗，TBST洗膜3次，加入二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，滴加ECL發(fā)光液后置于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光，采用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

2.8 免疫組織化學(xué)檢測心肌組織自噬蛋白的表達(dá) 取大鼠心肌組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，檸檬酸鈉進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS緩沖液沖洗，加入5%BSA，37 ℃封閉30 min，滴加一抗，4 ℃孵育過夜，加入二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色，終止顯色后蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每張片子隨機(jī)拍攝3個(gè)視野，采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析積分光密度(integrated optical density, IOD)值，其大小與蛋白表達(dá)呈正比。

3 結(jié)果

3.1 一般情況 假手術(shù)組大鼠沒有出現(xiàn)死亡情況，而模型組、鹿紅方組、氯喹組、鹿紅方+氯喹組大鼠分別有3、2、4、3只大鼠死亡。與假手術(shù)組比較，模型組、氯喹組、鹿紅方+氯喹組大鼠精神狀態(tài)較差，活躍度明顯減退，進(jìn)食量減少，體質(zhì)量增加不明顯，后期出現(xiàn)腹水、大便稀溏等癥狀；鹿紅方組大鼠上述情況均明顯改善。

3.2 鹿紅方對心肌梗死大鼠心功能的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVEF、LVFS降低(P<0.01)，LVIDd、LVIDs升高(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，鹿紅方組大鼠LVEF、LVFS升高(P<0.05，P<0.01)，LVIDd、LVIDs降低(P<0.05，P<0.01)；與鹿紅方組比較，鹿紅方+氯喹組大鼠LVEF、LVFS降低(P<0.05，P<0.01)，LVIDs升高(P<0.05)，LVIDd有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明鹿紅方對心臟的保護(hù)作用被氯喹所阻斷；與氯喹組比較，鹿紅方+氯喹組LVEF、LVFS、LVIDd、LVIDs無明顯變化(P>0.05)，見圖1。

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與鹿紅方組比較，&P<0.05，&&P<0.01。圖1 各組大鼠心功能Fig.1 Cardiac functions of rats in each group

3.3 鹿紅方對心肌梗死大鼠心肌組織病理形態(tài)的影響 假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊，極少量的膠原纖維沉積；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞變性、壞死，排列紊亂，局部心肌細(xì)胞被增生的結(jié)締組織取代，大量的膠原纖維沉積，纖維化面積增加(P<0.01)；與模型組比較，鹿紅方組大鼠心肌損傷減輕，細(xì)胞壞死、肥大改善，纖維化面積減少(P<0.01)；與鹿紅方組比較，鹿紅方+氯喹組大鼠心肌損傷加重，細(xì)胞大量水腫、壞死，結(jié)締組織增生和膠原纖維沉積增多，纖維化面積增大(P<0.01)；與氯喹組比較，鹿紅方+氯喹組大鼠心肌組織的病理表現(xiàn)類似，纖維化面積無明顯變化(P>0.05)，見圖2～4。

注：標(biāo)尺為100 μm。圖2 各組大鼠心肌組織HE染色Fig.2 HE staining of myocardial tissues of rats in each group

注：標(biāo)尺為1 000 μm/100 μm。圖3 各組大鼠心肌組織Masson染色Fig.3 Masson staining of myocardial tissues of rats in each group

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與鹿紅方組比較，&&P<0.01。圖4 各組大鼠心肌纖維化面積Fig.4 Myocardial fibrosis areas of rats in each group

3.4 鹿紅方對心肌梗死大鼠血清LDH、CK-MB活性的影響 LDH、CK-MB正常情況下位于心肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，心肌受損時(shí)會(huì)釋放入血，常用來評估心肌損傷的嚴(yán)重程度[12]。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清LDH、CK-MB活性升高(P<0.01)；與模型組比較，鹿紅方組大鼠血清LDH、CK-MB活性降低(P<0.01)；與鹿紅方組比較，鹿紅方+氯喹組大鼠血清LDH、CK-MB活性升高(P<0.01)；與氯喹組比較，鹿紅方+氯喹組大鼠血清LDH、CK-MB活性無明顯變化(P>0.05)，見圖5。

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與鹿紅方組比較，&&P<0.01。圖5 各組大鼠血清LDH、CK-MB活性Fig.5 Activities of serum LDH and CK-MB of rats in each group

3.5 鹿紅方對心肌梗死大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)的影響 假手術(shù)組大鼠肌節(jié)及肌絲完整、排列規(guī)則，線粒體結(jié)構(gòu)清晰，無破壞、腫脹；模型組大鼠心肌組織萎縮、溶解，肌絲斷裂，肌節(jié)破壞，線粒體部分腫脹、結(jié)構(gòu)破壞，胞質(zhì)中液泡狀的自噬體結(jié)構(gòu)增多；鹿紅方組大鼠心肌損傷減輕，肌節(jié)、肌絲排列規(guī)整，線粒體腫脹緩解，與模型組比較，胞質(zhì)中的自噬溶酶體數(shù)量增多；氯喹組及鹿紅方+氯喹組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)與模型組相似，液泡狀的自噬體結(jié)構(gòu)增多，見圖6。

3.6 鹿紅方對心肌梗死大鼠心肌組織中自噬蛋白表達(dá)的影響 氯喹是常用的自噬流抑制劑，能夠破壞溶酶體的酸性環(huán)境，損害溶酶體的功能，同時(shí)抑制自噬體與溶酶體的融合，使自噬過程不能完成，故LC3-Ⅱ、P62會(huì)積聚。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中Beclin1、LC3-Ⅱ、P62蛋白表達(dá)升高(P<0.05，P<0.01)，LAMP2蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，說明心梗后心肌組織存在溶酶體功能受損，自噬流受阻；與模型組比較，鹿紅方組大鼠心肌組織中Beclin1、LAMP2、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，P62蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，說明鹿紅方可以改善溶酶體的功能，促進(jìn)受損心肌的自噬流；與模型組比較，氯喹組大鼠心肌組織中LAMP2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，LC3-Ⅱ、P62蛋白表達(dá)升高(P<0.01)，證實(shí)了氯喹可以損害溶酶體的功能，阻礙自噬流的通暢；與鹿紅方組比較，鹿紅方+氯喹組大鼠心肌組織中LAMP2蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，LC3-Ⅱ、P62蛋白表達(dá)升高(P<0.01)，說明氯喹消除了鹿紅方對自噬的調(diào)節(jié)作用；與氯喹組比較，鹿紅方組+氯喹組大鼠心肌組織中Beclin1蛋白表達(dá)升高(P<0.01)，P62蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，LAMP2、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)無明顯變化(P>0.05)，見圖7。

3.7 鹿紅方對心肌梗死大鼠心肌組織中LC3B、P62表達(dá)的影響 LC3B、P62蛋白表達(dá)呈陽性時(shí)，在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間質(zhì)中可見棕黃色顆粒。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中LC3B、P62光密度值升高(P<0.05)；與模型組比較，鹿紅方組大鼠心肌組織中LC3B光密度值升高(P<0.05)，P62光密度值降低(P<0.01)，說明鹿紅方可增強(qiáng)心肌梗死大鼠心肌的自噬通量；與模型組比較，氯喹組大鼠心肌組織中LC3B、P62光密度值升高(P<0.01)；與鹿紅方組比較，鹿紅方+氯喹組大鼠心肌組織中LC3B、P62光密度值升高(P<0.01)；與氯喹組比較，鹿紅方+氯喹組大鼠心肌組織中LC3B和P62光密度值無明顯變化(P>0.05)，見圖8～9。

4 討論

心肌梗死后的數(shù)天至數(shù)周，心室重構(gòu)進(jìn)程啟動(dòng)，并進(jìn)行性出現(xiàn)容量負(fù)荷超載、心肌肥厚、心肌細(xì)胞死亡等失代償改變，最終導(dǎo)致心功能不斷惡化[13-14]。臨床上，雖然ACEI、ARB及β受體阻滯劑等藥物的廣泛應(yīng)用可以一定程度穩(wěn)定或改善心梗后患者的心功能障礙，但心梗后心衰的預(yù)后仍不理想，并且長期應(yīng)用也會(huì)導(dǎo)致耐藥性和不良反應(yīng)增多[15]。目前，越來越多的研究證實(shí)中醫(yī)藥治療心肌梗死療效確切，且具有毒副作用小的優(yōu)勢，中西醫(yī)結(jié)合論治心肌梗死已成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)與趨勢[16]。

注：A為心肌組織中LC3B免疫組化染色圖，B為LC3B光密度值定量分析統(tǒng)計(jì)圖。標(biāo)尺為100 μm。與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與鹿紅方組比較，&&P<0.01。圖8 各組大鼠心肌組織LC3B免疫組化Fig.8 LC3B immunohistochemistry in myocardial tissues of rats in each group

注：A為心肌組織中P62免疫組化染色圖，B為P62光密度值定量分析統(tǒng)計(jì)圖。標(biāo)尺為100 μm。與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與鹿紅方組比較，&&P<0.01。圖9 各組大鼠心肌組織P62免疫組化Fig.9 P62 immunohistochemistry in myocardial tissues of rats in each group

自噬是機(jī)體應(yīng)對損傷的一個(gè)過程，完整的自噬包括自噬前體的形成、自噬體的形成、自噬溶酶體的形成以及自噬溶酶體的降解，這整個(gè)發(fā)生過程稱為“自噬流”[17]。完整、順暢的自噬過程不僅可以通過三磷酸腺苷循環(huán)提供能量，還可以消除受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器來保護(hù)心臟，是心梗后維持正常心臟功能所必需的[18]。有研究表明，在使用海藻糖、雷帕霉素、白藜蘆醇等自噬激動(dòng)劑促進(jìn)或恢復(fù)受損心肌的自噬流后，限制了心肌缺血時(shí)的損傷，減少了慢性缺血重構(gòu)；而在抑制自噬的表達(dá)后，加劇了心梗后的缺血損傷及心功能障礙[19-23]。

在自噬調(diào)節(jié)的標(biāo)志物中，Beclin1是啟動(dòng)自噬的關(guān)鍵因子，是自噬小體形成所必須的，其表達(dá)量的高低與自噬活性呈正相關(guān)[24]。LC3-Ⅱ是自噬小體的標(biāo)志蛋白，其數(shù)量的增加既可能是自噬誘導(dǎo)，也可能是低效的溶酶體降解，要結(jié)合自噬流這一整體過程進(jìn)行評估[25]。P62是一種泛素結(jié)合蛋白，當(dāng)自噬溶酶體形成障礙，自噬降解速率降低時(shí)可在胞內(nèi)累積，其水平與自噬流的強(qiáng)弱呈反相關(guān)[26]。此外，一個(gè)健康、功能良好的溶酶體系統(tǒng)對于自噬流的整個(gè)過程也是至關(guān)重要的，而LAMP2正是調(diào)節(jié)溶酶體功能的關(guān)鍵因子，能促進(jìn)自噬體與溶酶體的融合[27]。本研究結(jié)果顯示，鹿紅方可以改善心梗大鼠的心功能，減少心肌纖維化的面積，減輕心肌組織結(jié)構(gòu)損傷，降低血清LDH、CK-MB活性；同時(shí)可以提高心梗大鼠心肌組織中Beclin1、LAMP2、LC3-Ⅱ表達(dá)，降低P62表達(dá)，增加心梗后心肌組織中自噬小體和自噬溶酶體的形成，促進(jìn)受損心肌的自噬流，但是在與氯喹合用后，鹿紅方的上述調(diào)節(jié)作用均被阻斷，提示鹿紅方至少部分通過促進(jìn)心肌細(xì)胞的自噬流來改善心梗后的心肌損傷和心功能障礙。

綜上所述，鹿紅方可以通過調(diào)節(jié)Beclin1/LAMP2介導(dǎo)的途徑，提高自噬小體的形成和促進(jìn)自噬流的通暢來減輕心肌梗死后的心臟功能障礙，發(fā)揮心臟保護(hù)作用。然而，調(diào)控Beclin1/LAMP2的上游通路眾多，鹿紅方是如何上調(diào)Beclin1/LAMP2表達(dá)的機(jī)制尚不明確，這將是本課題組下一步的研究計(jì)劃。