胃腸安丸揮發(fā)性成分分析及GC-MS指紋圖譜建立

尚 非， 柴麗娟， 王 怡， 張 晗， 王 琳， 王玉晶， 孫英杰， 張 鵬*

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，省部共建組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617；2.天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司樂(lè)仁堂制藥廠(chǎng)，天津 300019)

胃腸安丸收載于2020年版《中國(guó)藥典》一部[1]，由君藥木香、檀香、沉香，臣藥大黃、巴豆霜、枳殼、厚樸，佐使藥川芎、麝香、大棗組成，具有理氣止痛、健胃導(dǎo)滯之功效[2]，臨床用于治療腹瀉、納差、惡心等癥狀，主要含黃酮、木脂素、蒽醌、揮發(fā)油等成分。目前，對(duì)胃腸安丸的質(zhì)量控制主要針對(duì)其非揮發(fā)性成分，2020版《中國(guó)藥典》將厚樸酚、和厚樸酚作為質(zhì)控指標(biāo)，凌寧生[3]、張靜澤[4]等分別對(duì)柚皮苷、大黃蒽醌類(lèi)含量進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)雅昆[5]等對(duì)11種該類(lèi)成分進(jìn)行定量分析。方中木香、檀香、沉香、枳殼、厚樸等均含豐富的揮發(fā)性成分，是其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的重要組成，如木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯治療消化不良、腹瀉、腹痛等疾病[6]；檀香揮發(fā)油中的α-檀香醇、β-檀香醇等[7]對(duì)小腸運(yùn)動(dòng)亢進(jìn)有抑制作用[8]；沉香揮發(fā)性成分為倍半萜類(lèi)，具有抑菌、鎮(zhèn)痛、抗炎等藥理活性[9-10]，但目前缺乏相關(guān)質(zhì)量控制研究。因此，本實(shí)驗(yàn)采用GC-MS并結(jié)合保留指數(shù)法對(duì)胃腸安丸揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定，建立GC-MS指紋圖譜并進(jìn)行化學(xué)模式識(shí)別，以期為該制劑質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

GCMS-QP 2010氣質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀(配置NIST08.L譜庫(kù)，日本島津公司)；超純水機(jī)(天津市奧佳科技有限公司)；超聲波多頻清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Minispin plus離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；電子天平[十萬(wàn)分之一，梅特勒托利多儀器(上海)有限公司]。正構(gòu)烷烴(C10～C20)對(duì)照品溶液(美國(guó)Fluka公司)。乙酸乙酯(天津市康科德科技有限公司)。胃腸安丸共20批，購(gòu)自中新藥業(yè)天津樂(lè)仁堂制藥廠(chǎng)，具體信息見(jiàn)表1，選取批號(hào)1530941(S941)樣品用于指紋圖譜方法學(xué)考察。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備 精密稱(chēng)取本品0.25 g，研磨后置于EP管中，加入2.5 mL乙酸乙酯，超聲提取60 min，14 000 r/min離心10 min，取上清液，即得，進(jìn)樣200 μL分析。

2.2 色譜條件 DB-17MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 μm×0.25 μm)；載氣He，體積流量1 mL/min；柱箱溫度80 ℃；進(jìn)樣口溫度250 ℃；接口溫度280 ℃；進(jìn)樣量2 μL；初始柱溫80 ℃，保持2 min，20 ℃/min升至160 ℃，保持5 min，10 ℃/min升至240 ℃，保持10 min，4 ℃/min升至260 ℃，保持10 min，10 ℃/min升至280 ℃，保持2 min；溶劑延遲3.5 min。

2.3 質(zhì)譜條件 EI電離源，能量70 eV；離子源溫度230 ℃；質(zhì)量范圍m/z30～1 000；NIST08.L譜庫(kù)檢索。

2.4 成分鑒定 通過(guò)NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索匹配度高于80%的化合物，并直接鑒定其結(jié)構(gòu)。對(duì)于保留時(shí)間在C10～C20正構(gòu)烷烴范圍內(nèi)的成分，計(jì)算其保留指數(shù)(KI)，采用NIST匹配結(jié)合KI值進(jìn)行多重定性，即根據(jù)其保留時(shí)間計(jì)算其KI，與理論值比較，標(biāo)準(zhǔn)偏差閾值小于10%，可確定化合物結(jié)構(gòu)。

2.5 KI測(cè)定 取正構(gòu)烷烴混合對(duì)照品適量，在“2.2”“2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄保留時(shí)間，以其為標(biāo)準(zhǔn)找到相鄰2個(gè)正構(gòu)烷烴后計(jì)算KI[11]，公式為KI=100Z+100[TR(x)-TR(z)]/[TR(z+1)-TR(z)]，其中TR(x)、TR(z)、TR(z+1)分別為化合物及碳數(shù)為Z、Z+1正構(gòu)烷的保留時(shí)間，并且TR(z)

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液適量，在“2.2”“2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，以和厚樸酚保留時(shí)間、峰面積為參照，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%，表明該方法精密度良好。

2.6.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液適量，于0、2、6、8、12、24 h在“2.2”“2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，以和厚樸酚保留時(shí)間、峰面積為參照，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%(n=6)，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批本品適量，按“2.1”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.2”“2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，以和厚樸酚保留時(shí)間、峰面積為參照，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD均小于2.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 成分分析 取本品(批號(hào)1530603)適量，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”“2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，采用峰面積歸一化法計(jì)算揮發(fā)性成分相對(duì)含量，按“2.4”項(xiàng)下方法鑒定其結(jié)構(gòu)。結(jié)果，共發(fā)現(xiàn)102種成分，占總量的82.42%，主要包括酚類(lèi)(和厚樸酚、厚樸酚等)、脂肪酸(棕櫚酸、亞油酸、硬脂酸等)、酯類(lèi)(去氫木香內(nèi)酯、木香烴內(nèi)酯等)、萜烯(α-蒎烯、愈創(chuàng)木烯等)、醇類(lèi)[α-檀香醇、β-檀香醇、澳檀醇、α-桉葉醇、β-桉葉醇、(-)-4-萜品醇等]、氧化物(氧化石竹烯等)及其烴類(lèi)，具體見(jiàn)表2。

表2 揮發(fā)性成分鑒定結(jié)果

續(xù)表2

2.8 GC-MS指紋圖譜建立 20批樣品GC-MS指紋圖譜見(jiàn)圖1，再采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性和整體相似性評(píng)價(jià)，設(shè)定時(shí)間窗為0.1，以中位數(shù)法生成的對(duì)照譜為參照?qǐng)D譜進(jìn)行指紋匹配，共得到35個(gè)共有峰(圖2)，相似度均大于0.90。

圖1 20批樣品GC-MS指紋圖譜Fig.1 GC-MS fingerprints for twenty batches of samples

圖2 各揮發(fā)性成分共有峰Fig.2 Common peaks of various volatile components

2.9 化學(xué)模式識(shí)別

2.9.1 聚類(lèi)分析 采用R語(yǔ)言對(duì)GC-MS指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)分析，以共有峰峰面積為變量，聚類(lèi)方法選擇類(lèi)平均法，結(jié)果見(jiàn)圖3。由此可知，20批樣品按生產(chǎn)日期被聚為2類(lèi)，第1類(lèi)2批，為S605、S826；第2類(lèi)18批，為S932、S935、S936、S937、S938、S939、S940、S941、S942、S944、S953、S954、S955、S956、S957、S963、S964、S969。其中，第1類(lèi)樣品中硬脂酸、β-桉葉醇、澳檀醇(沸點(diǎn)113～115 ℃)[12]、1-異丙烯基-4-甲基-1,2-環(huán)己二醇含量顯著低于第2類(lèi)樣品，其中α-檀香醇、β-檀香醇、亞麻醇、鯊烯、亞油酸甲酯、8-(芐氧基)-1-萘酚含量更高，環(huán)扁桃酯、5,7,8-三甲基-二氫香豆素含量也略微升高。

2.9.2 主成分分析 采用SIMCA 14.1軟件對(duì)GC-MS指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，以共有峰峰面積為變量，結(jié)果見(jiàn)圖4。由此可知，20批樣品按生產(chǎn)日期被聚為2類(lèi)，第1類(lèi)2批，為S605、S826；第2類(lèi)18批，為S932、S935、S936、S937、S938、S939、S940、S941、S942、S944、S953、S954、S955、S956、S957、S963、S964、S969，與聚類(lèi)分析結(jié)果基本一致，印證了該方法的可靠性。

注：橫向?yàn)榫垲?lèi)樣品，縱向?yàn)榫垲?lèi)成分，數(shù)值代表峰面積大小(-3最小，0中等，3最大)。圖3 20批樣品聚類(lèi)熱圖Fig.3 Cluster heatmap for twenty batches of samples

圖4 20批樣品主成分分析得分圖Fig.4 Score plot for principal component analysis for twenty batches of samples

2.9.3 正交偏最小二乘判別分析 采用正交偏最小二乘判別分析對(duì)主成分分析結(jié)果作進(jìn)一步處理，結(jié)果見(jiàn)圖5A，可知R2Xcum=0.746，R2Ycum=0.955，Q2=0.773，均大于0.5，表明模型可靠。再篩選變量重要性投影值(VIP值)大于1的成分作為差異性成分，共發(fā)現(xiàn)12種(圖5B)，VIP值依次為β-檀香醇>α-檀香醇>亞油酸甲酯>鯊烯>亞麻醇>8-(芐氧基)-1-萘酚>硬脂酸>環(huán)扁桃酯>5,7,8-三甲基-二氫香豆素>澳檀醇>1-異丙烯基-4-甲基-1,2-環(huán)己二醇>β-桉葉醇，與聚類(lèi)分析結(jié)果一致。

圖5 20批樣品正交偏最小二乘判別分析、VIP值得分圖Fig.5 Score plots for orthogonal partial least square discriminant analysis and VIP values for twenty batches of samples

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)超聲溶劑法、水蒸氣蒸餾法進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)經(jīng)乙酸乙酯超聲提取后揮發(fā)性成分種類(lèi)豐富。保留指數(shù)法可用于鑒定相對(duì)含量較高、匹配度較低的成分，如厚樸酚、和厚樸酚，兩者具有抗胃潰瘍、解痙、止痛、抑菌、抗炎等作用[13-16]，是胃腸安丸主要藥效成分，將該方法與質(zhì)譜檢索相結(jié)合時(shí)，可提高鑒定的準(zhǔn)確性和全面性。

結(jié)果表明，20批樣品相似度差異較小，但共有峰峰面積差異較大。再用化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)，并改進(jìn)聚類(lèi)分析展現(xiàn)形式，最終篩選出12種差異成分，大多具有較強(qiáng)的活性，而且相對(duì)含量較高，其中α-檀香醇、β-檀香醇總含量占檀香揮發(fā)油的90%，可有效降低潰瘍數(shù)量，減小潰瘍面積[17]；β-桉葉醇能抑制潰瘍形成，抑制胃液分泌，是藥物發(fā)揮健脾燥濕作用的有效成分[18]。另外，不同批次樣品中澳檀醇等成分的含量差異可能與其沸點(diǎn)較低有關(guān)，隨著貯存時(shí)間延長(zhǎng)而更易揮發(fā)；α-檀香醇、β-檀香醇等成分的含量差異可能與藥材產(chǎn)地、采集時(shí)間有較大關(guān)系，提示在藥品生產(chǎn)過(guò)程中固定藥材來(lái)源產(chǎn)地、規(guī)范貯存條件、進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控的重要性。

綜上所述，α-檀香醇、β-檀香醇、β-桉葉醇等可作為胃腸安丸質(zhì)量控制的指標(biāo)成分，并且含量較高的活性物質(zhì)(如和厚樸酚、厚樸酚等)也應(yīng)在相關(guān)研究中加以重點(diǎn)關(guān)注。