HPLC-DAD法同時(shí)測定金花清感顆粒中7種成分

曹洪杰， 夏方亮， 邵曉瑋， 王玉林， 王建強(qiáng)， 王洪明

[1.濱州市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東 濱州 256600；2.濱州市化學(xué)藥物研發(fā)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(籌)，山東 濱州 256600]

金花清感顆粒是在2009年首個(gè)抗擊甲型H1N1流感的中成藥[1]，而在2020年該制劑在治療輕型、普通型新型冠狀病毒肺炎方面療效確切，退熱時(shí)間縮短，輕癥轉(zhuǎn)重癥比例降低[2-3]，被納入《新型冠狀病毒肺炎診療方案》試行第六版的推薦中成藥[4]。該制劑用于治療流行性感冒風(fēng)熱犯肺證，功效清熱解毒、疏風(fēng)宣肺，方中牛蒡子所含牛蒡苷具有明顯的抗病毒作用，黃芩所含黃芩苷、漢黃芩苷具有抗菌、抗病毒、抗血栓作用[5]，苦杏仁所含苦杏仁苷具有降氣、止咳、平喘作用[6]，知母所含芒果苷具有抗炎、降血糖、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等作用[7]，連翹所含連翹苷、連翹酯苷A等成分具有抗炎、抗病毒、抗菌等多種作用[8]。前期課題組查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，對金花清感顆粒的研究集中在流行性感冒[9-12]、新型冠狀病毒肺炎的臨床治療[2]及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[13-14]，尚無質(zhì)量控制方面的報(bào)道，并且相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[15]僅涉及鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、牛蒡子苷、薄荷腦的含量控制，操作復(fù)雜。因此，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-DAD法同時(shí)測定金花清感顆粒中苦杏仁苷、芒果苷、連翹酯苷A、黃芩苷、連翹苷、牛蒡苷、漢黃芩苷的含量，旨在實(shí)現(xiàn)該制劑全面的質(zhì)量控制。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司，精度0.01 mg)；KQ-300VDV 型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 黃芩苷(批號(hào)110715-201318，純度93.3%)、漢黃芩苷(批號(hào)112002-201702，純度98.5%)、芒果苷(批號(hào)11607-201704，純度98.1%)、牛蒡苷(批號(hào)110819-201108，純度94.6%)、連翹苷(批號(hào)110821-201816，純度95.1%)、連翹苷A(批號(hào)111810-201103，純度92.9%)、苦杏仁苷(批號(hào)110820-201808，純度88.2%)對照品及金銀花(批號(hào)121060-201608)、黃芩(批號(hào)120955-201810)、(草)麻黃(批號(hào)121051-201606)、甘草(批號(hào)120904-202021)、薄荷(批號(hào)120916-201812)、苦杏仁(批號(hào)121554-201204)、青蒿(批號(hào)121016-201506)、知母(批號(hào)121070-201806)、連翹(批號(hào)120908-201817)、浙貝母(批號(hào)120972-201906)、牛蒡子(批號(hào)120903-201811)對照藥材均購自中國食品藥品檢定研究院。金花清感顆粒[聚協(xié)昌(北京)藥業(yè)有限公司，批號(hào)20200218、20200228、20201005]購于康宇堂大藥房。甲醇、乙腈為色譜純(德國默克公司)；磷酸為分析純；水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備 精密稱取苦杏仁苷、芒果苷、連翹酯苷A、黃芩苷、連翹苷、漢黃芩苷、牛蒡苷對照品適量，甲醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.885 5、0.536 6、1.904 4、0.946 1、1.013 8、1.007 5、1.009 6 mg/mL的貯備液，分別精密量取適量，置于同一10 mL 量瓶中，甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得(各成分質(zhì)量濃度分別為35.421、10.732、19.044、75.685、10.138、102.168、20.193 μg/mL)。

2.2 供試品溶液制備 取3包本品內(nèi)容物，混勻，研細(xì)，精密稱取1 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加50%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取40 min，冷卻，50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，置于25 mL量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 陰性樣品溶液制備 根據(jù)處方分別制備缺炒苦杏仁、缺黃芩、缺連翹、缺牛蒡子、缺知母的陰性樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.4 色譜條件 Agilent XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～8 min，10%A；8～18 min，10%～14%A；18～35 min，14%～20%A；35～50 min，20%～32%A；50～60 min，32%～100%A；60～65 min，100%A；65～68 min，100%～10%A；68～78 min，10%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長207 nm(苦杏仁苷)、228 nm(芒果苷、連翹酯苷A、黃芩苷、連翹苷、牛蒡苷、漢黃芩苷)；進(jìn)樣量10 μL。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性考察 取供試品、對照品、陰性樣品溶液適量，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分色譜峰與相鄰峰之間的分離度均符合要求，理論塔板數(shù)均大于3 000，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.5.2 線性關(guān)系考察 取“2.1”項(xiàng)下貯備液適量，50%甲醇制成每1 mL分別含苦杏仁苷、芒果苷、連翹酯苷A、黃芩苷、連翹苷、漢黃芩苷、牛蒡苷177.11、53.66、95.22、378.42、50.69、100.96、510.84 μg的對照品溶液，逐級稀釋成系列質(zhì)量濃度，分別精密吸取20 μL，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，并分別以信噪比10∶1、3∶1為定量限、檢測限，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.苦杏仁苷 2.芒果苷 3.連翹酯苷A 4.黃芩苷 5.連翹苷 6.牛蒡苷 7.漢黃芩苷1. amygdalin 2. mangferin 3. forsythoside A 4. baicalin 5. forsythin 6. arctiin 7. wogonoside圖1 各成分HPLC-DAD色譜圖Fig.1 HPLC-DAD chromatograms of various constituents

2.5.3 精密度試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下對照品溶液，同一天在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，計(jì)算日內(nèi)精密度；每天測定2次，連續(xù)3 d，計(jì)算日間精密度，測得苦杏仁苷、芒果苷、連翹酯苷A、黃芩苷、連翹苷、漢黃芩苷、牛蒡苷兩者分別為1.9%、2.0%；1.3%、2.1%；1.7%、1.8%；0.21%、0.5%；0.7%、0.8%；0.4%、0.4%；0.14%、0.26%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下同一份供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12、24 h在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得苦杏仁苷、芒果苷、連翹酯苷A、黃芩苷、連翹苷、漢黃芩苷、牛蒡苷峰面積RSD分別為1.60%、1.55%、1.94%、0.32%、0.54%、0.61%、0.38%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批本品(批號(hào)20200218)6份，每份0.5 g，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得苦杏仁苷、芒果苷、連翹酯苷A、黃芩苷、連翹苷、漢黃芩苷、牛蒡苷峰面積RSD分別為0.70%、0.18%、1.82%、2.14%、2.01%、1.66%、2.07%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份各成分含量已知的本品(批號(hào)20200218)0.5 g，加入適量對照品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，苦杏仁苷、芒果苷、連翹酯苷A、黃芩苷、連翹苷、漢黃芩苷、牛蒡苷平均加樣回收率分別為98.36%、99.57%、99.24%、100.28%、99.33%、99.40%、99.85%，RSD分別為1.76%、0.58%、1.37%、0.83%、0.77%、1.17%、0.23%。

2.6 樣品含量測定 取3批本品，每批約0.5 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2 各成分含量測定結(jié)果(mg/g，n=3)

3 討論

3.1 提取條件選擇 本實(shí)驗(yàn)比較了不同提取溶劑(甲醇、70%甲醇、50%甲醇)、超聲時(shí)間(20、40、60 min)、溶劑用量(10、20、40 mL)的提取效果，最終確定20 mL 50%甲醇超聲提取40 min作為提取條件。

3.2 流動(dòng)相選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸能顯著提高各成分色譜峰與雜質(zhì)峰之間的分離度，并且峰形明顯更優(yōu)。

3.3 檢測波長選擇 本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測器對供試品、對照品溶液進(jìn)行全波長掃描(200～400 nm)，發(fā)現(xiàn)苦杏仁苷在207 nm波長處有最大吸收，而其他成分在228 nm波長處均有較好的紫外吸收，并且互不干擾，雜質(zhì)峰少，故選擇207、228 nm波長切換模式。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC-DAD法同時(shí)測定金花清感顆粒中黃芩苷、漢黃芩苷、牛蒡苷、芒果苷、連翹苷、連翹酯苷A、苦杏仁苷的含量，該方法簡便可靠，重復(fù)性好，可實(shí)現(xiàn)該制劑更有效全面的質(zhì)量控制。