一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定甘草瀉心湯中8種成分

唐紅梅， 翟少欽， 陳春林， 閆志強(qiáng)， 朱買勛

(重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460)

甘草瀉心湯始載于《傷寒論》，屬于國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》藥方之一[1]，組方藥材炙甘草、黃芩、黃連、干姜、半夏(洗)、大棗，具有益氣和胃、消痞止嘔之功效[2]，常用于治療急慢性胃腸炎癥[3]、白塞氏綜合癥等[4]，臨床療效顯著。在質(zhì)量控制方面，張?zhí)煲籟5]建立黃連、黃芩指紋圖譜，曹澤峰[6]采用HPLC法測(cè)定甘草苷、黃芩苷含量，但均難以滿足多成分同時(shí)檢測(cè)的要求，無法從整體上反映甘草瀉心湯質(zhì)量。

中藥復(fù)方組成復(fù)雜，全面評(píng)價(jià)其質(zhì)量應(yīng)兼具有效成分的數(shù)量和含量，但這不僅造成檢測(cè)成本增加，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致操作繁瑣，效率低下。一測(cè)多評(píng)法不僅能高效準(zhǔn)確地同時(shí)檢測(cè)多種成分含量，還可降低實(shí)驗(yàn)成本和操作難度，克服對(duì)照品緊缺或價(jià)格昂貴的問題，尤其適合解決難以全面控制中藥復(fù)方品質(zhì)的難題[7-8]。因此，本實(shí)驗(yàn)建立一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定甘草瀉心湯中姜酮、鹽酸黃連堿、甘草素、鹽酸小檗堿、漢黃芩苷、黃芩素、6-姜辣素、甘草酸銨的含量，以期為該方質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)；SB25-12D數(shù)控超聲波提取儀(寧波新芝生物科技有限公司)；AUW220D電子分析天平(日本島津公司)。

1.2 試劑與藥物 姜酮(批號(hào)110807-201802，純度≥99.9%)、鹽酸黃連堿(批號(hào)112026-201802，純度≥94.0%)、鹽酸小檗堿(批號(hào)110713-201212，純度≥86.7%)、漢黃芩苷(批號(hào)112002-201702，純度≥98.5%)、黃芩素(批號(hào)111595-201808，純度≥97.9%)、甘草酸銨(批號(hào)110731-202021，純度≥96.2%)對(duì)照品均購于中國食品藥品檢定研究院；甘草素(批號(hào)PS010083，純度≥98.0%)、6-姜辣素(批號(hào)PS012566，純度≥99.9%)對(duì)照品均購于成都普思生物科技股份有限公司。甘草瀉心湯(100 mL/瓶，批號(hào)20210322、20210329、20210430、20210513、20210603、20210701)及對(duì)應(yīng)的陰性樣品均由重慶市畜牧科學(xué)院獸醫(yī)獸藥研究所中獸藥制劑室提供。甲醇、乙腈、三氟乙酸為色譜純，均購于上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Sepax HP-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相0.1%三氟乙酸(A)-[甲醇-乙腈(1∶1)](B)，梯度洗脫，程序見表1；體積流量0.8 mL/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長282 nm；進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取姜酮、鹽酸黃連堿、甘草素、鹽酸小檗堿、漢黃芩苷、黃芩素、6-姜辣素、甘草酸銨對(duì)照品適量，50%甲醇稀釋定容，制成質(zhì)量濃度分別為2.064 4、1.662 4、1.906 0、1.752 0、1.977 8、2.272 2、1.862 4、1.004 4 mg/mL的貯備液，精密量取適量，50%甲醇稀釋定容，即得(各成分質(zhì)量濃度分別為0.516 1、0.415 6、0.476 5、0.438 0、0.494 5、0.568 1、0.465 6、0.251 1 mg/mL)。

2.2.2 供試品溶液 精密量取本品20 mL，加入20 mL甲醇-乙腈(1∶1)混合溶液提取，12 000 r/min離心5 min，取上清液20 mL，揮去溶劑，50%甲醇溶解定容至5 mL，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照處方及工藝分別制備缺甘草、缺黃芩、缺黃連、缺干姜的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分分離情況理想(分離度均大于1.5)，理論塔板數(shù)均不低于5 000，表明該方法專屬性良好。

1.姜酮 2.鹽酸黃連堿 3.甘草素 4.鹽酸小檗堿 5.漢黃芩苷 6.黃芩素 7.6-姜辣素 8.甘草酸銨1. vanillylacetone 2. coptisine hydrochloride 3.liquiritigenin 4. berberine hydrochloride 5. wogonoside 6. baicalein7.6-gingerol 8. ammonium glycyrrhizinate圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下貯備液0.05、0.10、0.25、0.40、0.50、0.75、1.00 mL，50%甲醇稀釋定容至10 mL，制成7個(gè)質(zhì)量濃度，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，每次10 μL，測(cè)得姜酮、鹽酸黃連堿、甘草素、鹽酸小檗堿、漢黃芩苷、黃芩素、6-姜辣素、甘草酸銨峰面積RSD分別為0.24%、0.37%、0.36%、0.36%、0.34%、0.36%、0.86%、1.02%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批本品(批號(hào)20210701)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得姜酮、鹽酸黃連堿、甘草素、鹽酸小檗堿、漢黃芩苷、黃芩素、6-姜辣素、甘草酸銨峰面積RSD分別為1.78%、1.45%、1.72%、0.73%、0.62%、1.73%、1.81%、1.62%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批本品(批號(hào)20210701)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、8、10、12 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得姜酮、鹽酸黃連堿、甘草素、鹽酸小檗堿、漢黃芩苷、黃芩素、6-姜辣素、甘草酸銨峰面積RSD分別為1.56%、1.48%、1.51%、0.86%、0.58%、1.57%、0.92%、1.87%，表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取6份各成分含量已知的本品(批號(hào)20210701，姜酮、鹽酸黃連堿、甘草素、鹽酸小檗堿、漢黃芩苷、黃芩素、6-姜辣素、甘草酸銨質(zhì)量濃度分別為0.241 3、0.311 8、0.566 9、0.131 9、0.666 4、0.127 9、0.114 3、0.288 5 mg/mL)10 mL，按100%水平加入適量對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，姜酮、鹽酸黃連堿、甘草素、鹽酸小檗堿、漢黃芩苷、黃芩素、6-姜辣素、甘草酸銨平均加樣回收率分別為102.87%、101.86%、98.65%、99.22%、104.17%、101.28%、98.79%、98.47%，RSD分別為1.26%、1.49%、1.27%、1.32%、0.94%、1.48%、1.15%、1.32%。

2.4 相對(duì)校正因子 分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下貯備液0.05、0.10、0.25、0.40、0.50、0.75、1.00 mL，50%甲醇稀釋定容至10 mL，制成7個(gè)質(zhì)量濃度(編號(hào)1～7)，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL測(cè)定，以鹽酸小檗堿為內(nèi)標(biāo)，采用多點(diǎn)校正法[9-11]計(jì)算其他7種成分的相對(duì)校正因子fk/s，公式為fk/s=fk/fs=(CkAs)/(CsAk)，其中Ck為其他成分含量，Ak為其他成分峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)含量，As為內(nèi)標(biāo)峰面積，結(jié)果見表3。

表3 各成分相對(duì)校正因子

2.5 耐用性考察

2.5.1 儀器、色譜柱 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，考察Agilent 1260、Waters e2695色譜儀及Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Sepax HP-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Sepax GP-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見表4，可知均無明顯影響(RSD<5%)。

表4 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響

2.5.2 體積流量 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在Agilent 1260色譜儀、Sepax HP-C18色譜柱下考察體積流量0.8、1.0、1.2 mL/min對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見表5，可知均無明顯影響(RSD<5%)。

表5 不同體積流量對(duì)相對(duì)校正因子的影響

2.5.3 柱溫 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在Agilent 1260色譜儀、Sepax HP-C18色譜柱下考察柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見表6，可知均無明顯影響(RSD<5%)。

表6 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響

2.6 色譜峰定位 在Agilent 1260、Waters e2695色譜儀下考察了Agilent ZORBAX SB-C18、Sepax HP-C18、Sepax GP-C18色譜柱中各成分相對(duì)保留時(shí)間tRi/s，計(jì)算公式為tRi/s=tRi/tRs，其中tRi為待測(cè)物保留時(shí)間，tRs為內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間[9-11]，結(jié)果見表7，可知均無明顯影響(RSD<5%)。

表7 各成分相對(duì)保留時(shí)間

2.7 樣品含量測(cè)定 取6批樣品(批號(hào)分別為20210322、20210329、20210430、20210513、20210603、20210701)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，分別采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法計(jì)算含量，結(jié)果見表8，可知2種方法所得結(jié)果接近，相對(duì)平均偏差(RAD)均小于2.0%。

表8 各成分含量測(cè)定結(jié)果(mg/mL，n=3)

3 討論

3.1 色譜條件選擇 8種成分在190～300 nm波長處有較好的吸收，而且在196、282 nm處較強(qiáng)，但196 nm處易與溶劑峰混合，會(huì)對(duì)成分檢測(cè)造成不良影響，故確定檢測(cè)波長為282 nm。在色譜分離實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，梯度洗脫對(duì)各成分的分離效果明顯優(yōu)于等度洗脫。甲醇選擇性弱于乙腈，但前者溶劑峰形更優(yōu)，故選擇甲醇-乙腈(1∶1)作為流動(dòng)相中的有機(jī)相，有利于各成分出峰；比較不同比例磷酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸的色譜效果，發(fā)現(xiàn)0.1%三氟乙酸作為流動(dòng)相中的水相時(shí)各成分出峰時(shí)間合適，峰形無拖尾，對(duì)稱性較好。另外，在體積流量0.8 mL/min、柱溫25 ℃、進(jìn)樣量10 μL時(shí)，各成分色譜峰分離度良好，峰形理想。

3.2 檢測(cè)指標(biāo)、內(nèi)標(biāo)選擇 甘草瀉心湯中以甘草、黃芩、黃連、干姜為主藥，大棗、半夏為輔藥[12]，但輔藥所含成分色譜峰吸收度較差，故本實(shí)驗(yàn)未對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)；甘草主要含有甘草素、甘草酸銨等成分[13]，黃芩主要含有漢黃芩苷、黃芩素等成分[14]，黃連主要含有鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿等成分[15]，干姜主要含有姜酮、6-姜辣素等成分[16]，這8個(gè)化合物在對(duì)應(yīng)藥理活性的起效機(jī)制中均存在直接關(guān)聯(lián)，故選擇其作為檢測(cè)指標(biāo)。另外，鹽酸小檗堿化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，容易獲得，色譜峰吸收度好，具有代表性[17-19]，故選擇其作為內(nèi)標(biāo)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首次建立一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定甘草瀉心湯中姜酮、鹽酸黃連堿、甘草素、鹽酸小檗堿、漢黃芩苷、黃芩素、6-姜辣素、甘草酸銨的含量，該方法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確可靠，所得結(jié)果與外標(biāo)法接近，可用于該方的質(zhì)量控制。