蒿竭通痹氣霧劑制備工藝的優(yōu)化

李 江， 張 希， 彭 霜， 郭媛媛， 楊 唯， 陳凌云， 李紹榮*， 余曉玲*

(1.昆明市中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650500；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南省高校外用給藥系統(tǒng)與制劑技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；3.普洱市民族傳統(tǒng)醫(yī)藥研究所，云南 普洱 665000)

蒿竭通痹方由雪上一枝蒿、馬錢子、龍血竭、紅花、細(xì)辛組成，具有活血止痛、祛風(fēng)散寒、除濕通痹、消腫通絡(luò)之功效，用于治療風(fēng)寒濕熱、淤血阻滯所致的關(guān)節(jié)疼痛，該方以白酒浸漬2周后制成酒劑，外用時(shí)以手涂抹藥液，按摩患處，但方中雪上一枝蒿、馬錢子毒性藥材，使用時(shí)可能由于附著于手而隨飲食入口，而且酒劑生產(chǎn)、保存、攜帶、運(yùn)輸、給藥均存在不便。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合藥味特性和臨床需求，將蒿竭通痹方開發(fā)成攜帶方便、質(zhì)量穩(wěn)定的氣霧劑，并對該制劑制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為其臨床推廣奠定基礎(chǔ)，也為其他中藥復(fù)方酒劑改制成氣霧劑提供了新的方法和思路。

1 材料

安捷倫1100高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)；CP124C電子天平[奧豪斯儀器(上海)有限公司]。雪上一枝蒿甲素(批號110895-200404)、馬錢子堿(批號110706-200505)、士的寧(批號110705-20030)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。雪上一枝蒿(批號X18041910)、馬錢子(批號M18062001)、紅花(批號H18030701)、細(xì)辛(批號XX18031401)、龍血竭(批號L18062006)均由昆明市中醫(yī)醫(yī)院提供，有檢驗(yàn)合格報(bào)告。乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝優(yōu)化

2.1.1 原料藥含量測定

2.1.1.1 雪上一枝蒿甲素 精密稱取80 ℃下干燥至恒重的對照品適量，甲醇制成100 μg/mL對照品溶液；取藥材粉末約0.5 g，精密稱定，加1 mL濃氨試液，密封，浸漬30 min，加25 mL甲醇，稱定質(zhì)量，超聲提取1 h(53 kHz，100 W)，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，取10 mL續(xù)濾液，蒸干，甲醇溶解，定容至5 mL，作為供試品溶液。

色譜條件[1]為Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈-[0.01 mol/L庚烷磺酸鈉與0.02 ml/L磷酸二氫鉀等量混合溶液(10%磷酸調(diào)節(jié)pH至2.8)](17∶83)；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長210 nm；進(jìn)樣量10 μL，發(fā)現(xiàn)雪上一枝蒿甲素色譜峰與附近雜質(zhì)峰分離度良好，理論塔板數(shù)不低于2 000。

以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得方程為Y=3.32X+2.66(r=0.999 7)，在16.50～264.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密度試驗(yàn)中，雪上一枝蒿甲素峰面積RSD為0.79%(n=6)，表明儀器精密度良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)中，對照品、供試品溶液中雪上一枝蒿甲素峰面積RSD分別為0.80%、0.33%，表明溶液在0、4、8、12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。重復(fù)性試驗(yàn)中，雪上一枝蒿甲素含量RSD為1.22%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。取6份雪上一枝蒿甲素含量已知(4.91 μg/mL)的同一批藥材，加入281.00 μg/mL對照品溶液4 mL，制備供試品溶液，測得該成分平均加樣回收率為101.19%，RSD為2.35%。取藥材(批號X18041910)4份，測得雪上一枝蒿甲素平均含量為6.19 mg/g(RSD=0.13%)。

2.1.1.2 馬錢子堿、士的寧 取藥材(批號M18062001)4份，按2020年版《中國藥典》方法測定，得馬錢子堿、士的寧平均含量分別為19.26、20.59 mg/g，RSD分別為0.09%、0.18%。

2.1.2 提取液含量測定

2.1.2.1 溶液制備 精密稱取雪上一枝蒿甲素(在80 ℃下干燥至恒重)、馬錢子堿、士的寧對照品適量，甲醇制成質(zhì)量濃度分別為100、200、200 μg/mL的對照品溶液。按處方比例取1/5量的藥材共12 g，乙醇提取后合并醇提液，定容(提取1、2、3次時(shí)定容至500 mL，4次時(shí)定容至1 000 mL)，濾過，作為供試品溶液，同法分別制備缺雪上一枝蒿、缺馬錢子的陰性樣品溶液。

2.1.2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) Diamonsil C18色譜柱；流動相乙腈(A)-[0.01 mol/L庚烷磺酸鈉與0.02 ml/L磷酸二氫鉀等量混合溶液(10%磷酸調(diào)節(jié)pH至2.8)](B)，梯度洗脫(0～13 min，16.5%A；13～15 min，16.5%～24.0%A)；體積流量1.3 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長210 nm(雪上一枝蒿甲素)、265 nm(馬錢子堿)、255 nm(士的寧)；進(jìn)樣量10 μL，色譜圖見圖1。由此可知，各成分分離度良好(均不小于1.97)，理論塔板數(shù)按雪上一枝蒿甲素計(jì)不低于1 500，陰性無干擾。

1. 雪上一支蒿甲素 2. 馬錢子堿 3. 士的寧1. bullatine A 2. brucine 3. strychnine圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.2.3 方法學(xué)考察 取對照品溶液2.5 mL(雪上一枝蒿甲素、馬錢子堿、士的寧質(zhì)量濃度分別為238.40、464.92、459.39 μg/mL)，甲醇定容至5 mL，取2.5 mL，甲醇定容至5 mL，按上述比例反復(fù)稀釋，在“2.1.2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得雪上一枝蒿甲素、馬錢子堿、士的寧方程分別為Y=17.16X+31.60(r=0.999 9)、Y=8.30X+22.24(r=0.999 9)、Y=3.62X+10.81(r=0.999 4)，分別在14.90～238.40、29.06～464.92、28.72～459.39 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密度試驗(yàn)中，3種成分峰面積RSD分別為1.64%，1.69%，0.64%(n=6)，表明儀器精密度良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)中，對照品溶液中3種成分峰面積RSD分別為1.68%、1.16%、0.88%，供試品溶液中分別為1.55%、0.50%、0.87%，表明溶液在0、4、8、12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。重復(fù)性試驗(yàn)中，3種成分含量RSD分別為2.02%、2.20%、1.45%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。取6份3種成分含量已知(分別為33.48、103.97、102.56 μg/mL)同一批提取液，加入對照品溶液(3種成分質(zhì)量濃度分別200.20、630.83、431.26 μg/mL)1 mL，按“2.1.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得3種成分平均加樣回收率分別為96.78%、100.31%、98.52%，RSD分別為1.94%、2.54%、2.34%。

2.1.3 單因素試驗(yàn)

2.1.3.1 轉(zhuǎn)移率、綜合評分 以雪上一枝蒿甲素、馬錢子堿、士的寧轉(zhuǎn)移率及浸膏得率為評價(jià)指標(biāo)[2]，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，計(jì)算公式為轉(zhuǎn)移率=(1 g藥材提取液中相應(yīng)成分含量/1 g藥材中相應(yīng)成分含量)×100%[3]，再計(jì)算綜合評分Z1，公式為Z1=[(雪上一枝蒿甲素轉(zhuǎn)移率/最大值)×0.25+(馬錢子堿轉(zhuǎn)移率/最大值)×0.25+(士的寧轉(zhuǎn)移率/最大值)×0.25+(干膏得率/最大值)×0.25]×100。

2.1.3.2 粉碎粒徑、提取方法、乙醇體積分?jǐn)?shù) 參考文獻(xiàn)[4]報(bào)道，采用單因素試驗(yàn)對粉碎粒徑(飲片、80%過1號篩同時(shí)過2號篩的不超過30%、80%過4號篩同時(shí)過6號篩的不超過30%)、提取方法[固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%，回流提取條件為提取3次，第1次料液比1∶10提取3 h，第2次料液比1∶8提取2 h，第3次料液比1∶5提取1 h；超聲提取條件為53 kHz、100 W提取2次，料液比1∶10，提取時(shí)間1 h；浸漬提取條件為浸漬3次，料液比1∶8，浸漬時(shí)間1周；滲漉提取條件為料液比1∶8浸漬12 h后按1∶15比例滲漉提取，體積流量0.25 mL/(12 g·min)]、乙醇體積分?jǐn)?shù)(35%、45%、55%、65%、75%)進(jìn)行考察。結(jié)果，篩選出最優(yōu)粉碎粒徑為80%過1號篩同時(shí)過2號篩的不超過30%，提取方法為回流提取，乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%。

2.1.3.3 浸泡時(shí)間、吸液量 組方藥材按“2.1.3.2”項(xiàng)下規(guī)格粉碎，稱取6份，每份12 g，55%乙醇(料液比1∶10)浸漬，每15 min取1份樣品，濾盡浸漬液，稱定藥渣質(zhì)量，平行操作2次，測得最佳吸液量為(64.52±1.90)%，浸泡時(shí)間為60 min。吸液量計(jì)算公式為吸液量=(浸漬后藥渣質(zhì)量/浸漬前藥渣質(zhì)量)×100%。

2.1.3.4 料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù) 采用單因素試驗(yàn)對料液比(1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16)、提取時(shí)間(20、40、60、80、100 min)、提取次數(shù)(1、2、3)進(jìn)行考察。結(jié)果，最優(yōu)料液比為1∶12，提取時(shí)間為60 min，提取次數(shù)為2次。

2.1.4 AHP-CRITIC法結(jié)合Box-Behnken設(shè)計(jì)

2.1.4.3 AHP-CRITIC混合加權(quán)法 按公式Wf=Wj-AHPWj-CRITIC/∑Wj-AHPWj-CRITIC，計(jì)算雪上一枝蒿甲素轉(zhuǎn)移率、馬錢子堿轉(zhuǎn)移率、士的寧轉(zhuǎn)移率、浸膏得率復(fù)合權(quán)重系數(shù)(Wf)測得四者分別為0.155、0.286、0.336、0.223。采用SPSS 18.0軟件對AHP與CRITIC的復(fù)合權(quán)重系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，測得相關(guān)系數(shù)為-0.969，表明2種賦權(quán)方法存在較大差異，無疊加性。再對Box-Behnken設(shè)計(jì)中AHP、CRITIC、AHP- CRITIC法所得綜合評分進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)AHP與CRITIC、AHP與AHP-CRITIC、CRITIC與AHP-CRITIC的相關(guān)系數(shù)分別為0.960、0.997、0.977，表明3種賦權(quán)方法具有一致性，所得復(fù)合權(quán)重系數(shù)可靠。

表1 CRITIC法計(jì)算各指標(biāo)相關(guān)參數(shù)

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)結(jié)果

2.1.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 采用小試工藝規(guī)模，取標(biāo)準(zhǔn)處方量藥材共100 g，按“2.1.4”項(xiàng)下優(yōu)化工藝進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)。測得平均綜合評分為102.97分(RSD=3.47%)，與預(yù)測值99.28分接近(相對誤差為3.72%)，表明該工藝穩(wěn)定可靠。

2.2 濃縮工藝優(yōu)化 以雪上一枝蒿甲素、馬錢子堿、士的寧保留率為評價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)優(yōu)化濃縮工藝。結(jié)果，最優(yōu)工藝為先在(65±5)℃、(0.06±0.01)MPa下將提取液濃縮至1 mL/0.1 g原藥材，再在常壓下濃縮至1 g/3 g原藥材，各成分平均保留率為79.94%(n=2)。

2.3 成型工藝優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗(yàn) 以雪上一枝蒿甲素、馬錢子堿、士的寧保留率為評價(jià)指標(biāo)，對乙醇體積分?jǐn)?shù)(70%、80%、85%、90%、95%)進(jìn)行考察，確定為90%乙醇。參考文獻(xiàn)[13]報(bào)道，以沉淀、分層、拋射劑與藥液相溶性，噴射狀態(tài)為評價(jià)指標(biāo)，對拋射劑種類及用量(固定藥液30 mL，分別與15、21、27、33 g四氟乙烷、丙丁烷、異丁烷構(gòu)成12個(gè)組合)，附加劑種類及用量(固定藥液30 mL，組合見表3)進(jìn)行考察，確定為丙丁烷用量為21～27 g，甘油用量為3 g，丙二醇用量為1～1.5 g。

2.3.2 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以丙丁烷用量(A2)、甘油用量(B2)、丙二醇用量(C2)為影響因素，評價(jià)指標(biāo)見表4，采用正交試驗(yàn)作進(jìn)一步優(yōu)化，結(jié)果見表5，最終確定最優(yōu)工藝為藥液用量30 mL，丙丁烷用量21 g，甘油用量3 g，丙二醇用量1.5 g，綜合評分為95分，方差分析見表6，可知丙丁烷用量有顯著影響(P<0.05)。再按上述優(yōu)化工藝進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)[14]，測得平均綜合評分為94分，與預(yù)測值95分接近，表明該工藝穩(wěn)定可靠。

表3 成型工藝單因素試驗(yàn)水平

表4 成型工藝評分標(biāo)準(zhǔn)

表5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表6 方差分析

3 討論

課題組前期對蒿竭通痹方中雪上一枝蒿、馬錢子2味君藥和貴細(xì)藥材龍血竭(不參與提取，在配液時(shí)用95%乙醇溶解后與其余藥材提取物混合)進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，并起草了相關(guān)草案。為了保障制備工藝研究的可靠性，本實(shí)驗(yàn)所用藥材均為同一批次，并且均符合上述要求。

在提取工藝優(yōu)化過程中，本實(shí)驗(yàn)選擇雪上一枝蒿甲素、馬錢子堿、士的寧轉(zhuǎn)移率作為評價(jià)指標(biāo)，這3種成分均具有抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛功效[15-16]，與蒿竭通痹方臨床適應(yīng)癥相關(guān)；原方采用白酒浸漬后入藥，故直接選擇乙醇作為提取溶劑；浸膏得率作為另1個(gè)評價(jià)指標(biāo)，由于在單因素試驗(yàn)中無法計(jì)算混合權(quán)重系數(shù)，故上述4個(gè)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)均設(shè)為0.25。再采用AHP-CRITIC混合加權(quán)法進(jìn)行賦權(quán)，該方法與單一的Delphi賦權(quán)、AHP賦權(quán)、CRITIC賦權(quán)比較具有更高的可靠性。

在成型工藝優(yōu)化過程中，本實(shí)驗(yàn)以沉淀、分層情況為主要評價(jià)指標(biāo)，同時(shí)結(jié)合2020年版《中國藥典》四部通則0113對于非定量外用氣霧劑的要求，選擇噴射速率、噴出總量、內(nèi)壓作為次要評價(jià)指標(biāo)，并對上述指標(biāo)的得分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行具體劃分，再結(jié)合正交設(shè)驗(yàn)，可使所選處方更合理。

綜上所述，AHP-CRITIC混合加權(quán)法結(jié)合Box-Behnken試驗(yàn)可使蒿竭通痹方提取工藝研究更合理，而在該方成型工藝優(yōu)化過程中評分標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合正交試驗(yàn)?zāi)芨咝Э煽康睾Y選處方。