幾種傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉細菌多樣性分析

于士軍，江 隆，柴新義，徐馨怡，涂真真

（滁州學院 生物與食品工程學院，安徽 滁州 239000）

豆豉是我國傳統(tǒng)特色豆制品調(diào)味料，營養(yǎng)豐富，藥食兼用。豆豉是以黑豆或大豆為主要原料，在微生物發(fā)酵大豆蛋白達到一定程度時，加入鹽、酒或者采取干燥等方法降低酶活性、延緩發(fā)酵過程而制成。豆豉種類繁多，根據(jù)發(fā)酵微生物不同，分為細菌型豆豉、曲霉型豆豉、毛霉型豆豉、根霉型豆豉、脈孢菌類豆豉五種[1]。從古至今，豆豉在我國人民的飲食文化和醫(yī)療保健中發(fā)揮著重要作用，其特殊的制作工藝體現(xiàn)了學界對我國古代科學技術的繼承和發(fā)展[2]。

利用微生物在適宜的養(yǎng)分、溫度和濕度等條件下自然發(fā)酵是傳統(tǒng)豆豉最常用的生產(chǎn)方法。在不同地域，主要發(fā)酵微生物也不同，形成了由優(yōu)勢微生物（如米曲霉或毛霉）主導的微生物群落，并賦予了各地豆豉獨特的風味、色澤、形態(tài)及益生功能[3]。近年來，國內(nèi)學者對傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉微生物多樣性、風味形成機理、理化特性和營養(yǎng)成分等進行了深入研究。鄭多多等從云南地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中分離出了枯草芽孢桿菌[4]；徐雪晗等從隴南地區(qū)的豆豉中發(fā)現(xiàn)了苯甲酰肼、丁酸乙酯、正戊醇等特有的揮發(fā)性成分[5]；馮霞等發(fā)現(xiàn)水豆豉具有較高的水分、較低的溫度和酸度，有利于細菌生長[6]。研究發(fā)現(xiàn)，豆豉還含有可溶性蛋白氮、B族維生素以及多種生物酶等營養(yǎng)成分[7]。石聰?shù)壤酶咄繙y序技術分析了瀏陽豆豉不同發(fā)酵階段的微生物多樣性，結果表明：在豆豉發(fā)酵15天時微生物OTU數(shù)顯著增多[8]。李曉然等發(fā)現(xiàn)西雙版納的豆豉具有較高的微生物群落多樣性，且嗜鹽菌較多[9]。

本文以我國傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉為研究對象，利用高通量測序技術對4種不同地區(qū)的豆豉細菌群落結構多樣性進行研究，探討細菌多樣性與豆豉品質(zhì)之間的聯(lián)系，為改善和提高傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉的品質(zhì)提供理論依據(jù)，對促進傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉的科學生產(chǎn)和工業(yè)化進程具有重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：重慶永川豆豉（DC1)，重慶市永川豆豉食品有限公司；廣東陽江豆豉（DC2），廣東陽帆食品有限公司；江西湖口豆豉（DC3），九江石鐘山豆制品有限公司；云南菌香豆豉（DC4），云南宏斌綠色食品集團有限公司。Fast DNASPIN Kit for Soil試劑盒（MP Biomedicals，USA）；亞鐵氰化鉀、氨水（25%）、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、乙酸鋅、鹽酸、冰乙酸、鉻酸鉀、氫氧化鈉、酚酞、硝酸、硝酸銀等均為分析純，亞硝酸鈉溶液標準物（200μg/mL）、乙醇（純度≥95%）、氯化鈉（純度≥99.8%）。

儀器：物性測試儀（TA.XT plus）、高速臺式冷凍離心機（TGL-20M）、電泳儀（JY600C）、凝膠成像系統(tǒng)（GenoSens1850）、分析天平（BSA224S）、pH計（PHS-3E）、渦旋混合儀（XH-01N）、紫外可見分光光度計（UV-5100）。

1.2 理化指標分析

水分測定參照《食品中水分的測定》（GB5009.3-2016）的直接干燥法；亞硝酸鹽測定參照《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB5009.33-2016）的分光光度法；氯化物測定參照《食品中氯化物的測定》（GB5009.44-2016）的銀量法。pH測定：稱取3.00 g豆豉，加入27 mL去離子水，利用均質(zhì)機高速攪拌勻漿（15 000 r/min），靜置15 min，用pH計測定懸浮液pH值。使用TA.XT plus物性測試儀分析樣品硬度、黏性、咀嚼性等（探頭A/BE，測試速度1.0 mm/s，壓縮形變量70%）。

1.3 MiSeq高通量測序

分別將10 g豆豉樣品加入到40 mL無菌蒸餾水中，用拍擊器拍打5 min，在4°C、5 000 r/min條件下離心5 min，取上清液分析。利用Fast DNASPIN Kit for Soil試劑盒提取細菌總DNA，使用紫外可見分光光度計檢測DNA濃度，并根據(jù)D260/D280值判定DNA純度。以總DNA為模板，選用細菌通用引物（5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3'，5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對細菌16S rRNAV4區(qū)進行擴增，然后利用Miseq平臺進行高通量測序，每個樣品重復3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過QIIME軟件（v1.8.0，http://qiime.org/）對高通量測序結果進行修整、歸并和劃分，得到高質(zhì)量OTU統(tǒng)計表，并計算Simpson、Chao1、ACE、Shannon多樣性指數(shù)。在不同分類水平上（門、綱、目、科、屬）生成4種豆豉的物種豐度表和物種分布圖，并使用R軟件對豐度前50位的菌屬進行聚類分析和繪制熱圖。

2 結果與分析

2.1 理化分析結果

由表1可知，4種豆豉的水分含量存在顯著差異，從大到小依次為：重慶永川豆豉、廣東陽江豆豉、云南菌香豆豉、江西湖口豆豉；pH值從大到小依次為：江西湖口豆豉、云南菌香豆豉、廣東陽江豆豉、重慶永川豆豉，其中，DC4和DC2的pH值差異不明顯（P＞0.05）。豆豉pH值的高低會影響微生物生長，大多數(shù)細菌在pH 4～10的環(huán)境中均能生長，而放線菌適合在偏堿性環(huán)境下生長。4種豆豉的亞硝酸鈉含量分別為1.44 mg/kg、1.18 mg/kg、1.05 mg/kg和0.91 mg/kg，均小于《食品添加劑使用標準》（GB 2760-2014）中規(guī)定的最大殘留量30 mg/kg。4種豆豉的鹽分均在（2.09～4.65 g/100 g）之間，其氯化鈉含量從大到小依次為：重慶永川豆豉、廣東陽江豆豉、云南菌香豆豉、江西湖口豆豉，低于豆醬（10.9 g/100 g）和火腿（8～10 g/100 g）等傳統(tǒng)發(fā)酵食品。4種豆豉的硬度大小依次為：江西湖口豆豉、廣東陽江豆豉、云南菌香豆豉、重慶永川豆豉。而黏性從大到小依次為：江西湖口豆豉、廣東陽江豆豉、重慶永川豆豉、云南菌香豆豉。此外，咀嚼性從大到小依次為：江西湖口豆豉、廣東陽江豆豉、重慶永川豆豉、云南菌香豆豉。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，江西湖口豆豉的硬度、黏性和咀嚼性均大于其余3種豆豉，可能與其低水分有關。

表1 不同豆豉的理化指標檢測結果

2.2 序列長度分布

基于高通量測序，4種豆豉共獲得代表序列211 335條，其中，重慶永川豆豉53 686條、廣東陽江豆豉59 805條、江西湖口豆豉42 586條、云南菌香豆豉55 258條。

2.3 細菌群落多樣性分析

在97%相似度下，利用QIIME軟件分析4種豆豉的特征性OTU及其豐度信息（圖1和表2）。由圖1可知，4種豆豉的OUT數(shù)共有2 776個，其中，重慶永川豆豉、廣東陽江豆豉、江西湖口豆豉、云南菌香豆豉分別有OTU數(shù)603、517、484和1 173個。4種豆豉共有的OTU數(shù)為30個，而DC1、DC2、DC3、DC4中特有的OTU數(shù)分別為244、214、314、752，其余OTU為部分豆豉之間共有。

表2 4種豆豉細菌OTU劃分和分類水平統(tǒng)計表

圖1 4種豆豉的細菌OTU分布維恩圖（97%水平下）

由圖2可知，在97%相似度下，重慶永川豆豉、廣東陽江豆豉、江西湖口豆豉稀釋曲線已達到飽和狀態(tài)；云南菌香豆豉稀釋曲線基本達到飽和狀態(tài)，表明4種豆豉中大多數(shù)細菌物種信息均能被反映出來。

圖2 4種豆豉的細菌OTU稀釋曲線

4種豆豉的Simpson、Chao1、ACE和Shannon多樣性指數(shù)如表3所示。可知，4種豆豉的細菌群落豐富度從大到小依次為：云南菌香豆豉、重慶永川豆豉、廣東陽江豆豉、江西湖口豆豉。江西湖口豆豉的細菌群落多樣性最高（6.90），廣東陽江豆豉的細菌群落多樣性最低（4.20），多樣性從大到小依次為：江西湖口豆豉、云南菌香豆豉、重慶永川豆豉、廣東陽江豆豉。

表3 4種豆豉細菌多樣性指數(shù)表

2.4 細菌群落結構分析

2.4.1 門水平的優(yōu)勢菌群分布特征

4種豆豉細菌群落組成在門水平上的分布如圖3所示，主要有厚壁菌門（Firmicutes，60.62%±37.77%）、變形菌門（Proteobacteria，21.00%±18.11%）、藍細菌門（Cyanobacteria，10.13%±18.53%）。不同區(qū)域豆豉優(yōu)勢細菌相對豐度存在差異，其中，廣東陽江豆豉的厚壁菌門豐度最高（91.7%），其次是重慶永川豆豉（74.0%）、江西湖口豆豉（71.1%），最低的是云南菌香豆豉（5.6%）；變形菌門豐度最高的是云南菌香豆豉（46.4%），其次是重慶永川豆豉（20.0%）和江西湖口豆豉（13.5%），最低的是廣東陽江豆豉（4.2%）；而藍細菌門豐度最高的是云南菌香豆豉（37.9%），其次是重慶永川豆豉（2.0%）和廣東陽江豆豉（0.5%），而江西湖口豆豉則不含此門類。結果表明，4種豆豉的優(yōu)勢菌群存在明顯差異，重慶永川豆豉、廣東陽江豆豉和江西湖口豆豉的優(yōu)勢菌群為厚壁菌門（Firmicutes），云南菌香豆豉為變形菌門（Proteobacteria）和藍細菌門（Cyanobacteria）。

圖3 4種豆豉的細菌群落結構及分布（門水平）

微生物是影響豆豉風味的重要因素[10]。4種豆豉的細菌群落結構存在一定相似性，優(yōu)勢菌主要集中在厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、藍細菌門（Cyanobacteria），以及放線菌門（Actinobacteria）。厚壁菌門（Firmicutes）是一類革蘭氏陽性菌，主要包括芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）等，其中，芽孢桿菌屬（Bacillus）和巨型球菌屬（Macrococcus）可耐受10%鹽度和55°C高溫，有利于豆豉在后熟階段的發(fā)酵[11]。變形菌門（Proteobacteria）是一類革蘭氏陰性菌，是細菌界中最大的一個門類[12]，其中Beta-變形菌綱的Massilia屬具有脫氮作用，可將硝酸鹽還原為氮氣[13]，從而降低豆豉發(fā)酵過程中硝酸鹽轉化為亞硝酸鹽的可能[14]。藍細菌門（Cyanobacteria）是一類革蘭氏陰性菌，適應環(huán)境能力強，能在低溫、高堿等極端環(huán)境下生存[15]，其中，銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）可降解糖原并產(chǎn)生CO2、乙醇和醋酸等物質(zhì)[16]，若豆豉發(fā)酵過程中有該菌參與，可能會影響豆豉pH及酸味。此外，放線菌門（Actinobacteria）是一類革蘭氏陽性菌，其中，馬杜拉放線菌（Actinomadura sp.）是一種稀有放線菌，可產(chǎn)生高抗腫瘤活性的抗生素[17]，若存在于豆豉中則可提升其益生功能。

2.4.2 屬水平的優(yōu)勢菌群分布特征

4種豆豉的細菌群落組成在屬水平上存在明顯差異（見圖4），其中，重慶永川豆豉的優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬（Bacillus，52.07%），還存在食酸菌屬（Acidovorax）。研究表明，芽孢桿菌（Bacillus）與豆豉的酸味呈正相關，與鮮味及咸味呈負相關，對豆豉滋味有影響[18]，而且枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）可使豆豉具有抗菌、溶血栓以及抗癌等功能[19]；食酸菌屬（Acidovorax）是一類重要的三價砷氧化菌，可將三價砷氧化為五價砷[20]，從而降低豆豉砷的毒性。

圖4 4種豆豉的細菌群落結構及分布（屬水平）

廣東陽江豆豉的優(yōu)勢菌屬為四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus，67.77%）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus，10.43%）和芽孢桿菌屬（Bacillus，7.73%），其中，嗜鹽四聯(lián)球菌（Tetragenococcus halophilus）是四聯(lián)球菌屬中最常見的一種細菌，在食品發(fā)酵過程中可提高有機酸、醛類和酯類等風味物質(zhì)含量[21]；乳酸桿菌是一種有益菌，可產(chǎn)生乳酸、過氧化氫等抗菌物質(zhì)來抑制致病菌[22]，能延長豆豉保藏期，還能產(chǎn)生醇、醛和酮等多種風味物質(zhì)[23]，使豆豉既美味又有益于人體健康[24]。

江西湖口豆豉的優(yōu)勢菌屬為葡萄球菌屬（Staphylococcus，54.36%）、擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis，10.63%）和芽孢桿菌屬（Bacillus，10.62%）。葡萄球菌屬是一種革蘭氏陽性球菌，多數(shù)為非致病菌，少數(shù)可導致疾病，如金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[25]，其中，木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌可分解蛋白質(zhì)和脂肪并提升食品風味[26]。擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis）可代謝產(chǎn)生吲哚并咔唑類化合物，此類產(chǎn)物具有抗腫瘤、抗感染和抗過敏作用[27]，有利于豆豉益生功能的提升。

云南菌香豆豉的優(yōu)勢菌屬為水茄屬（Solanum torvum，31.21%）、假單胞菌屬（Pseudomonas，4.97%）、勞爾氏菌屬（Ralstonia，4.81%）。其中，水茄屬（Solanum torvum）具有清熱解毒、活血消腫、祛風利濕等功效，以及抗真菌、抗腫瘤等活性[28]；假單胞菌屬分泌的酪氨酸酶可以催化酪氨酸合成L-3,4-二羥基苯丙氨酸，可用來預防和治療帕金森綜合征[29]。

此外，在江西湖口豆豉和云南菌香豆豉中還發(fā)現(xiàn)了一些致病菌，可能是其發(fā)酵或包裝過程中受到了環(huán)境微生物的污染。例如，江西湖口豆豉中的變形桿菌（Proteus）是一種革蘭氏陰性致腐菌，可引發(fā)食物中毒[30]，并引起如呼吸道感染[31]、肺炎[32]、肺結核[33]等多種感染性疾病。云南菌香豆豉中的不動桿菌（Acinetobacter）是一種革蘭氏陰性病原菌，有較強的耐藥性，例如，鮑曼不動桿菌能夠引起肺炎、腦膜炎、組織感染等疾病[34]。

2.5 PCA主成分分析

基于屬水平的4種豆豉微生物群落結構組成的PCA分析如圖5所示?？芍?，4種豆豉之間的離散程度都較大，表明重慶永川豆豉、廣東陽江豆豉、江西湖口豆豉和云南菌香豆豉之間細菌群落結構在屬水平差異較大，相似度較低。

圖5 4種豆豉的細菌群落結構PCA分析（屬水平）

2.6 群落組成熱圖分析

對4種豆豉中豐度前50的菌屬進行聚類分析，并繪制熱圖，如圖6所示?？芍?，4種豆豉的細菌群落結構存在差異，且云南菌香豆豉細菌群落豐度最高，其次是重慶永川豆豉和江西湖口豆豉，而廣東陽江豆豉最低。

圖6 4種豆豉細菌群落組成熱圖（屬水平）

3 結論

本研究以重慶永川豆豉、廣東陽江豆豉、江西湖口豆豉和云南菌香豆豉等4個不同產(chǎn)地的傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉為對象，對豆豉的水分含量、pH值、氯化鈉含量、亞硝酸鹽含量、質(zhì)構、細菌群落結構多樣性等進行了詳細研究。江西湖口豆豉的水分含量最低（16.18%），其硬度及咀嚼性最大。4種豆豉的鹽分范圍在2.09～4.65（g/100 g）之間，豆豉pH值分別為5.06、5.36、6.27、5.37。4種豆豉的細菌共屬于28門、58綱、134目、221科、440屬、633種，其優(yōu)勢菌屬存在差異。不同產(chǎn)地豆豉的細菌多樣性差異可能與使用原料、發(fā)酵工藝、發(fā)酵起始微生物等因素有關。芽孢桿菌對豆豉滋味有影響，乳酸桿菌、四聯(lián)球菌和葡萄球菌對豆豉風味有影響，水茄屬、擬諾卡氏菌和假單胞菌能提升豆豉益生功能。