實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)在艾滋病合并肺結(jié)核的診斷價(jià)值研究

李珊 李金明 陳絳青通訊作者 賴啟南 任慧芳

（1 南昌市第九醫(yī)院感染二科 江西 南昌 330002；2 南昌市第九醫(yī)院檢驗(yàn)科 江西 南昌 330002）

繼發(fā)性肺結(jié)核（TB）和艾滋病病毒（AIDS）合并感染是臨床診斷上十分棘手的問題，一旦發(fā)生合并感染則是臨床預(yù)后不佳的主要驅(qū)動因素。據(jù)報(bào)道，結(jié)核病是艾滋病毒感染者死亡的一個(gè)主要原因，2011 年全球有43 萬結(jié)核分枝桿菌/艾滋病病毒雙重感染患者（TB/AIDS 雙感染患者）死亡，TB/AIDS 雙感染患者的死亡率是普通結(jié)核患者的21～34 倍[1]。改善結(jié)核病/艾滋病毒合并感染的檢測方式可以促進(jìn)這兩種情況的早期治療，并對治療結(jié)果產(chǎn)生積極影響[2]。但TB/AIDS 雙感染患者的臨床表現(xiàn)不典型，肺部影像學(xué)不特異，痰涂片找抗酸桿菌陽性率低，在基層醫(yī)院易漏診、誤診，是目前面臨的主要困難[3]。Gene Xpert MTB/RIF 檢測是一種實(shí)時(shí)PCR 檢測，是一種設(shè)計(jì)鎖定、全盒內(nèi)測試，研究已證明了其檢測肺結(jié)核的快速性、精準(zhǔn)性。但由于Gene Xpert MTB/RIF檢測在TB/AIDS 雙感染患者中的研究十分缺乏，本研究旨在通過與其它3 種臨床常用的檢測方法對比，探討Gene Xpert MTB/RIF 在TB/AIDS 雙感染患者中的診斷價(jià)值，以期為臨床提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年～2021 年在南昌市第九醫(yī)院感染科就診的40 例AIDS 感染合并肺結(jié)核患者，與同期40 例非AIDS 肺結(jié)核患者同時(shí)行Gene Xpert MTB/RIF、BACTET MFIT 960、T-SPOT、抗酸染色涂片法檢測，對結(jié)果進(jìn)行分析比較。入組患者均需要簽署知情同意書，且本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。最終符合入組的患者80 例。AIDS/TB 組中男22例，女18 例，平均年齡（42.7±13.9）歲；TB 組中男19 例，女21 例，平均年齡（46.4±12.3）歲。

診斷標(biāo)準(zhǔn)：艾滋病的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國艾滋病診療指南（2018 版）》[4]，肺結(jié)核的診斷參照《肺結(jié)核的診斷指南》[5]。

TB 組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）具備繼發(fā)性肺結(jié)核影像學(xué)表現(xiàn)特征者；（2）2 份痰標(biāo)本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性者；（3）分枝桿菌培養(yǎng)陽性、菌種鑒定為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群者；（4）結(jié)核分枝桿菌核酸檢測陽性者；（5）肺組織或肺外組織病理學(xué)檢查證實(shí)為結(jié)核病變者；（6）年齡＞18 周歲者；（7）知情同意、具有配合檢查意愿者。

AIDS/TB 組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合TB 組的納入條件者；（2）HIV-antibody（+）和HIV 補(bǔ)充試驗(yàn)（+）者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）免疫相關(guān)制劑正使用者；（2）合并其他免疫系統(tǒng)疾病者；（3）合并其他病原體、嚴(yán)重感染者。（4）排除其他肺部疾病如腫瘤等者；（5）排除合并嚴(yán)重高血壓、糖尿病等其他慢性病患者。

1.2 研究方法

1.2.1Gene Xpert MTB/RIF 檢測。取研究對象1份晨痰，按規(guī)范操作程序進(jìn)行Acetylcysteine 消化處理，隨后用1.1ml 的磷酸鹽緩沖液作為底液將消化完成后的菌液重懸于其中，取0.5ml 用于Gene Xpert MTB/RIF 系統(tǒng)檢測，純化的核酸、單個(gè)樣品和定量PCR 擴(kuò)增測定被整合在一個(gè)封閉的系統(tǒng)中。然后用超聲波對樣品進(jìn)行破碎，將內(nèi)部的DNA釋放到一個(gè)由閥門驅(qū)動的封閉流動系統(tǒng)中。然后清洗、純化、濃縮來自不同流動細(xì)胞的DNA，并將其加入定量PCR 室，與PCR 反應(yīng)試劑混合進(jìn)行定量PCR 擴(kuò)增。樣品在試劑盒側(cè)面進(jìn)行了條碼化處理，從洗過的樣品中取出1ml，放在帶螺旋蓋的預(yù)處理管中，作為樣品管使用。打開樣品處理液瓶，將其放入試管中，密封瓶蓋子，將試管搖晃20 次（旋渦混合器中搖晃20s）。讓試管在室溫下放置15min 之后在再次依照前面的方法搖動試管，使其液化。然后打開管子，用無菌吸管吸入2 毫升已凈化的液體。并加入到Gene Xpert 系統(tǒng)中檢測，標(biāo)本上需要加入帶有標(biāo)本條形碼，試劑盒蓋子上需要加上試劑盒條形碼，在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中掃描標(biāo)本條形碼和試劑盒條形碼，打開設(shè)備的閃光燈，該套件被放置在模塊中進(jìn)行自動測試。將試劑盒放在模塊托盤中進(jìn)行自動測試，2 小時(shí)后反應(yīng)結(jié)束時(shí)在測試窗口下獲得結(jié)果。

1.2.2 T-SPOT 檢測方法。在給予患者適當(dāng)關(guān)懷后，伸展患者的手臂，在肘窩處抽取患者8～10ml 外周靜脈血，之后置于肝素抗凝管中2 個(gè)工作日之后出結(jié)果。第一天進(jìn)行外周血核細(xì)胞提取，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，加樣，過夜培養(yǎng)之后，第二天加入酶標(biāo)二抗工作液，洗版，顯色然后再次洗板后，烘干經(jīng)顯色反應(yīng)之后，可進(jìn)行讀數(shù)核對結(jié)果。須對斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，計(jì)算出抗原特異性的效應(yīng)T細(xì)胞頻數(shù)，從而判斷結(jié)核分枝桿菌感染情況。Gene Xpert MTB/RIF 及試劑盒和T-SPOT 試劑盒購自上海原鑫生物有限責(zé)任公司，BACTEC MGIT 960檢測系統(tǒng)采用美國BD 公司的全自動分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測儀，抗酸染色涂片采用合肥思潤生物科技有限公司。

1.3 觀察指標(biāo)

各組病例均行Gene Xpert MTB/RIF、T-SPOT、BACTET MFIT 960 和抗酸染色涂片檢測，以結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)（+）為金標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算各種檢測方法的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值并比較不同CD4+T 水平對診斷的影響。將結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)（+）的人群定義為a，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)（-）的人群定義為b，由4 種檢測方式檢測為（+）的人群定義為c，4 種檢測方式檢測為（-）的人群定義為d，計(jì)算公式：敏感性=a/（a+c），特異性=d/（b+d），陽性預(yù)測值a/（a+b），陰性預(yù)測值=d/（c+d）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用X2檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者不同檢測方法的陽性率比較

兩組患者不同檢測方法的陽性率比較結(jié)果見表1?？傮w陽性檢出率上，TB 組均高于AIDS/TB 組，但兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。AIDS/TB 組中，陽性檢出率最高的是T-SPOT 法（80%），與Gene Xpert MTB/RIF 法相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.133），較其余兩種方法有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.009 及0.002），抗酸染色涂片法陽性檢出率最低僅有47.5%。TB 組中陽性檢出率最高的是T-SPOT 法，與Gene Xpert MTB/RIF 法相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.264），但與BACTET MFIT 960 法和抗酸染色涂片法相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.022 及0.007）。

表1 兩組患者不同檢測方法的陽性率比較（%）

2.2 CD4+T 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)表達(dá)水平與不同檢測方法的陽性率

在AIDS/TB 組的40 例患者中，組間比較顯示，4 種方法的陽性率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。依據(jù)CD4+T 表達(dá)水平分組，組內(nèi)比較顯示在≥200個(gè)/μL 組中，Gene Xpert MTB/RIF（57.50%）及T-SPOT（60.00%）的陽性率較高，但與BACTET MFIT 960 及抗酸染色涂片法檢測的陽性率相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在＜200 個(gè)/μL 組中，BACTET MFIT 960（47.50%）及抗酸染色涂片法（50.00%） 檢測陽性率較高，但與Gene Xpert MTB/RIF（42.50%）及T-SPOT（40.00%）的陽性率相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同CD4+T 水平艾滋病合并患者繼發(fā)性肺結(jié)核4 種檢測方法結(jié)果（%）

3 討論

AIDS 最常見的機(jī)會性感染就是TB，二者合并感染后?；ハ嘧鳛榇龠M(jìn)因素，使病情發(fā)展進(jìn)入惡性循環(huán)，其流行病學(xué)典型表現(xiàn)就是合并率高，致死率高，但臨床表現(xiàn)卻又不典型。其各類癥狀、體征、實(shí)驗(yàn)室及影像學(xué)表現(xiàn)與普通肺結(jié)核表現(xiàn)不一致，誤診、漏診率高。故臨床上對AIDS/TB 盡早明確診斷，及時(shí)規(guī)范治療的需求愈發(fā)迫切。目前在基層醫(yī)院，肺結(jié)核的檢測方法有限，基本限于痰培養(yǎng)、TSPOT 法、BACTET MFIT 960 或者痰涂片找抗酸桿菌，它們均有一定的局限性從而限制了臨床的開展，如痰涂片找抗酸桿菌操作雖然簡單，但檢出率低，陽性率僅40%左右，且涂片檢出不能分辨活菌、死菌，不能鑒別結(jié)核分枝桿菌或非結(jié)核分枝桿菌；BACTET MFIT 960 檢測法在實(shí)際檢測中需將無菌標(biāo)本放入有放射性14CO2的培養(yǎng)瓶中，其底物可能存在放射性物質(zhì)，不可避免造成環(huán)境污染，且檢測昂貴，局限了在臨床中的普及。因此，目前的醫(yī)院需要高敏感性和特異性，快速、簡單，對使用技術(shù)要求不高的結(jié)核病診斷方法。

綜上所述，Gene Xpert MTB/RIF 用于對結(jié)核分枝桿菌/艾滋病病毒雙重感染患者的診斷效能突出，診斷速度較快，具有臨床推廣價(jià)值。