采后常溫貯藏下菠蘿罹病果實(shí)轉(zhuǎn)錄組測序分析

摘""要：菠蘿在常溫貯藏過程中易發(fā)生黑心病，為了探索黑心病的發(fā)生機(jī)制，選取菠蘿黑心病初期果實(shí)的發(fā)病部位和健康部位，每個部位選取3個樣本分別進(jìn)行測轉(zhuǎn)錄組RNA-Seq分析，對差異基因進(jìn)行GO、KEGG、各代謝通路基因表達(dá)聚類分析和RT-qPCR驗(yàn)證，對比病部（IB）和健部（WT）的差異基因表達(dá)量。通過分析發(fā)現(xiàn)，IB"vs"WT共有1037個差異基因，其中上調(diào)886個，下調(diào)130個。GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn)氨基酸生物合成差異基因最顯著，而且差異基因數(shù)量占比大；通過聚類分析和RT-qPCR驗(yàn)證，糖代謝路徑發(fā)現(xiàn)果實(shí)發(fā)病后糖酵解、三羧酸循環(huán)（TCA）和氧化磷酸化過程中相關(guān)酶基因表達(dá)量顯著上調(diào)；植物應(yīng)對外界環(huán)境信號通路發(fā)現(xiàn)抗性酶基因表達(dá)量顯著下調(diào)，致病蛋白基因表達(dá)量顯著上調(diào)，抗病蛋白基因表達(dá)量顯著下調(diào)；抗氧化物質(zhì)通路發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽合成基因表達(dá)量顯著下調(diào)，類黃酮生物合成相關(guān)基因表達(dá)量顯著上調(diào)，L-抗壞血酸過氧化物酶（APX）基因表達(dá)量顯著下調(diào)，而L-抗壞血酸氧化酶（AOX）同系物基因表達(dá)量顯著上調(diào)。RNA-Seq和RT-qPCR分析結(jié)果表明，菠蘿組織通過顯著上調(diào)糖代謝關(guān)鍵基因加速果實(shí)病部糖代謝、顯著上調(diào)表達(dá)信號傳導(dǎo)關(guān)鍵通路MAPK途徑中的關(guān)鍵基因以及顯著下調(diào)抗氧化物質(zhì)等代謝通路變化而導(dǎo)致黑心病的發(fā)生。通過這些結(jié)果可以豐富菠蘿黑心病發(fā)生的基因網(wǎng)絡(luò)，為后續(xù)菠蘿黑心病相關(guān)基因篩選提供信息參考。

關(guān)鍵詞：常溫貯藏；菠蘿；黑心??；RNA-Seq分析中圖分類號：S667.9""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Transcriptome"Sequencing"Analysis"of"Diseased"Pineapple"Fruits"Stored"at"Room"Temperature"after"Harvest

ZHANG"Mengzhuo，"NA"Qiting，"ZHU"Changsong，"CAO"Hui，"LIU"Shiying，"SHI"Xuequn，"MENG"Lanhuan*

School"of"Food"Science"and"Engineering，"Hainan"University，"Haikou，"Hainan"570228，"China

Abstract："Pineapple"is"prone"to"intern"browning"during"storage"at"room"temperature."Diseased"and"healthy"parts"of"pineapple"at"early"stage"of"intern"browning"were"used"to"explore"the"mechanism"of"the"disease."Three"samples"from"each"part"were"used"for"transcriptome"RNA-Seq"analysis."GO，"KEGG，"cluster"analysis"of"gene"expression"in"various"metabolic"pathways，"and"RT-qPCR"validation"on"differential"genes"were"performed"and"the"differential"gene"expression"levels"between"the"diseased"（IB）"and"healthy"（WT）"parts"were"compared."IB"vs"WT"had"1037"differentially"expressed"genes，"of"which"886"were"up-regulated"and"130"were"down-regulated."GO"and"KEGG"analysis"found"that"the"differentially"expressed"genes"in"amino"acid"biosynthesis"were"the"most"significant，"and"the"proportion"of"differentially"expressed"genes"was"large."Cluster"analysis"and"RT-qPCR"validation"found"that"the"sugar"metabolism"pathway"significantly"up-regulated"the"expression"levels"of"related"enzyme"genes"in"glycolysis，"tricarboxylic"acid"cycle"（TCA），"and"oxidative"phosphorylation"processes"after"fruit"disease"onset."The"response"of"plants"to"external"environmental"signaling"pathways"revealed"a"significant"down-regulation"of"resistance"enzyme"gene"expression，"a"significant"up-regulation"of"pathogenic"protein"gene"expression，"and"a"significant"down-regulation"of"resistance"protein"gene"expression."The"antioxidant"pathway"revealed"significant"down-regulation"of"glutathione"synthesis"gene"expression，"significant"up-regulation"of"flavonoid"biosynthesis"related"gene"expression，"significant"down-regulation"of"L-ascorbate"peroxidase"（APX）"gene"expression，"and"significant"up-regulation"of"L-ascorbate"oxidase"（AOX）"homologous"gene"expression."RNA-Seq"and"RT-qPCR"analysis"indicated"that"pineapple"tissue"significantly"up-regulated"key"genes"in"sugar"metabolism"to"accelerate"sugar"metabolism"in"fruit"disease"part，"significantly"up-regulated"key"genes"in"the"MAPK"signaling"pathway，"and"significantly"down-regulated"metabolic"pathway"changes"such"as"antioxidant"substances，"leading"to"pineapple"intern"browning."The"results"could"enrich"the"gene"network"of"pineapple"intern"browning"and"provide"a"valuable"reference"for"the"subsequent"gene"screening"of"pineapple"intern"browning.

Keywords："room"temperature"storage;"pineapple;"intern"browning;"RNA-Seq"analysis

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.11.006

菠蘿（Ananas"comosus"L.），屬鳳梨屬，又名鳳梨，僅次于香蕉和芒果的第三大熱帶水果，是世界四大名果之一[1-2]。原產(chǎn)于南美洲巴西、巴拉圭[3]，現(xiàn)已在熱帶地區(qū)廣泛種植。菠蘿深受消費(fèi)者喜愛，它風(fēng)味獨(dú)特，富含膳食纖維、有機(jī)酸、維生素B1、維生素C、類胡蘿卜素、鉀及多種礦物質(zhì)等物質(zhì)[4]，其中菠蘿蛋白酶是一種促消化和抗炎的物質(zhì)[5-7]。中國的菠蘿產(chǎn)地面積位居世界第4位，產(chǎn)量為世界第6位，雖然我國是菠蘿生產(chǎn)和消費(fèi)大國，但仍不是菠蘿貿(mào)易強(qiáng)國[8-9]。

菠蘿黑心?。╞lack"heart），也稱內(nèi)部褐變?。╥nternal"browning，"IB），是一種生理代謝失調(diào)病[10]，一般從果實(shí)外部無法觀察，切開果實(shí)才能發(fā)現(xiàn)。黑心病初發(fā)時，在果實(shí)基部的果心兩側(cè)出現(xiàn)水漬狀斑點(diǎn)，之后斑點(diǎn)顏色變暗、范圍變大；發(fā)展嚴(yán)重時，病斑聯(lián)合一起，使大部分果肉褐變[11]。研究發(fā)現(xiàn)，果實(shí)內(nèi)部褐變與酚類物質(zhì)氧化成醌類、活性氧（reactive"oxygen"species，"ROS）、膜脂過氧化等有關(guān)[12-13]。目前證明可延緩黑心病的方法包括氯化鈣[14]、熱誘導(dǎo)[15]、水楊酸[16]、1-甲基丙烯（1-methylcyclopropene，"1-MCP）[17-18]和打蠟協(xié)同效應(yīng)[19]、外源抗壞血酸[20]等處理，但仍難以實(shí)現(xiàn)廣泛應(yīng)用，黑心病仍是影響菠蘿商品價值和流通性的主要病害。

2015年福建農(nóng)林大學(xué)首次破譯了菠蘿基因組[21]，在菠蘿基因組的研究取得了很大的進(jìn)展，但目前多是對菠蘿幼苗、花進(jìn)行測序來研究果實(shí)生長發(fā)育[22-24]，菠蘿果實(shí)黑心病相關(guān)基因的研究甚少，僅發(fā)現(xiàn)AcPPO[25]、AcGA2ox[26]、AcCYS1[27]和AcPLD2/9[28]等可能與黑心病相關(guān)，且其功能也未進(jìn)行驗(yàn)證。

因此，我們對常溫貯藏6"d發(fā)病初期果實(shí)的病部和健部進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組RNA-Seq分析，其主要包括：首先對測序結(jié)果進(jìn)行總體數(shù)據(jù)可行性證明；然后對差異基因進(jìn)行基因本體論（gene"ontology，"GO）基因功能注釋和京都基因與基因組百科全書（Kyoto"Encyclopedia"of"Genes"and"Genomes，"KEGG）富集分析得到主要的代謝通路；最后對糖代謝、植物應(yīng)對外界環(huán)境的信號通路和抗氧化物質(zhì)相關(guān)通路進(jìn)行差異基因聚類分析，可得到菠蘿果實(shí)黑心病發(fā)生路徑。本研究對黑心病如何發(fā)生有了更全面的了解，同時可得到一些相關(guān)基因，為今后通過分子手段控制黑心病發(fā)生提供新思路。

1""材料與方法

1.1""材料

巴厘菠蘿（Ananas"comosus"cv."Comtede"Paris）于2021年10月采收于海南省瓊海市，并于3"h內(nèi)送至海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院采后果蔬保鮮實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行貯藏，挑選果實(shí)大小均一，無病害果實(shí)。果實(shí)貯藏于（25±1）"℃，相對濕度（RH）為（85±5）%環(huán)境。貯藏6"d后選取初期發(fā)病果實(shí)，取其病部和健部（圖1），分別取3組，每組3個果實(shí)，迅速置于液氮中凍樣，用干冰運(yùn)輸，送至天津諾禾致源科技有限公司進(jìn)行有參轉(zhuǎn)錄組測序分析。健部（WT）：C1、C2、C3，病部（IB）：IB1、IB2、IB3。

1.2""方法

1.2.1""樣品收集和準(zhǔn)備""使用Agilent"2100"bioanalyzer精確檢測RNA完整性和總量；然后構(gòu)建文庫，后進(jìn)行質(zhì)檢；質(zhì)檢合格后上機(jī)進(jìn)行Illumina測序。

1.2.2""測序數(shù)據(jù)分析""首先對原始數(shù)據(jù)中質(zhì)量較低的reads進(jìn)行過濾，得到高質(zhì)量的clean"data。然后使用HISAT2"v2.0.5構(gòu)建參考基因組的索引，并使用HISAT2"v2.0.5將配對末端clean"reads與參照基因組比對；采用StringTie（1.3.3b）進(jìn)行新基因預(yù)測；對于有生物學(xué)重復(fù)的樣本，使用DESeq2（1.20.0）軟件進(jìn)行差異表達(dá)分析。通過clusterProfiler（3.8.1）軟件進(jìn)行差異表達(dá)基因的GO和KEGG"富集分析。

1.2.3""實(shí)時熒光定量PCR分析""首先，用天根多糖多酚RNA試劑盒提取菠蘿果實(shí)病部和健部果實(shí)RNA；接著使用天根FastKing"gDNA"Dispelling"RT"SuperMix試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；最后利用網(wǎng)站https：//primer3.ut.ee/設(shè)計(jì)特異性引物（表1），然后通過天根FastReal"qPCR"PreMix（SYBR"Green）試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序：95"℃預(yù)變性5"min；95"℃變性10"s，60"℃退火30"s，72"℃延伸30"s，40個循環(huán)；最后72"℃延伸10"min。按照2-ΔΔCt方法計(jì)算[29]。

1.3""數(shù)據(jù)處理

采用Graphpad"prism"10.1軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析。

2""結(jié)果與分析

2.1""轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

對各樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量評估發(fā)現(xiàn)，WT和IB組間的樣本分散，組內(nèi)3個樣本聚集，表明樣本間生物學(xué)重復(fù)好（圖2A）；盒型圖（圖2B）可直觀地看到各樣本的基因分布情況，每個樣本從下往上可以看出基因分布越來越少。樣本間相關(guān)性均大于0.8，組內(nèi)相關(guān)性數(shù)值相近，組間相關(guān)性數(shù)值差值大（圖2C），表明樣本可靠，可用于后續(xù)分析。

2.2""差異表達(dá)基因數(shù)目

差異基因數(shù)目分析發(fā)現(xiàn)，WT和IB組共有基因?yàn)?4"586個（圖3A）；IB"vs"WT的差異表達(dá)基因有1037個，其中上調(diào)基因886個，下調(diào)基因130個，上調(diào)基因的數(shù)量遠(yuǎn)大于下調(diào)基因（圖3B）。

2.3""GO和KEGG富集分析

GO"分析發(fā)現(xiàn)（圖4A），分子功能（molecular"function，"MF）顯著性富集，其中輔酶結(jié)合（coenzyme"binding）基因顯著上調(diào)且差異基因數(shù)量最多；生物過程（biological"process，"BP）顯著性次之，其中藥物代謝過程（drug"metabolism"process）基因顯著上調(diào)且差異基因數(shù)量最多；細(xì)胞成分"（cellular"components，"CC）無顯著性富集。

KEGG代謝通路中（圖4B），氨基酸生物合成（amino"acid"biosynthesis）通路中基因表達(dá)差異倍數(shù)最高且差異基因數(shù)最多（22個），其次為苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成（biosynthesis"of"phenylalanine，"tyrosine"and"tryptophan）（9個），氨基糖和核苷酸糖代謝（amino"sugar"and"nucleotide"sugar"metabolism）（11個），苯丙烷類生物合成（phenylpropane"biosynthesis）（9個）等。

2.4""糖代謝路徑分析

菠蘿是糖含量豐富的水果之一，有研究表明果實(shí)褐變會加速糖代謝，糖含量降低[30-31]，對糖的3個生物氧化過程分析發(fā)現(xiàn)。首先，糖酵解中葡萄糖在有氧條件下丙酮酸激酶基因（109727427、109726650、109726809、109710080、109722348）表達(dá)上調(diào)生成烯醇式酮酸，之后在非酶促反應(yīng)下生成丙酮酸；在無氧條件下，乳酸脫氫酶基因（109727043）表達(dá)上調(diào)生成乳酸，丙酮酸脫羧酶基因（109719677）表達(dá)上調(diào)生成乙醛，乙醇脫氫酶基因（109706271、109720821、109721267）上調(diào)表達(dá)生成乙醇（圖5A）。

然后，糖酵解生成的丙酮酸可以通過丙酮酸激酶催化生成乙酰CoA進(jìn)入三羧酸循環(huán)（tricarboxylic"acid"cycle，"TCA）（圖5B），其關(guān)鍵酶檸檬酸合酶基因（109710242、109708439、109710921、109724956）上調(diào)表達(dá)，異檸檬酸脫氫酶基因（109716911、109710820）上調(diào)表達(dá)，а-酮戊二酸脫氫酶基因（109723651、109725790）上調(diào)表達(dá)，表明機(jī)體會加速代謝以獲取能量。

最后，在線粒體內(nèi)膜糖、脂或氨基酸發(fā)生氧化磷酸化（圖5C），共有5個系統(tǒng)。復(fù)合體Ⅰ中NADH-Q還原酶基因（109709714、109703559、109709706、109711193、109723703、109716813、109719455、109708116、109703616、109708945、109728114、109727605）上調(diào)表達(dá)；復(fù)合體Ⅱ中琥珀酸-Q還原酶基因（109710134）上調(diào)表達(dá)；復(fù)合體Ⅲ細(xì)胞色素還原酶基因（109726546、109728610、109723560）上調(diào)表達(dá)；復(fù)合體Ⅳ細(xì)胞色素氧化酶基因（109703608、109716203、109722390、109711772、109725159、109725842、109717914）上調(diào)表達(dá)；復(fù)合體ⅤATP合酶基因（109720628、109710804、109722176、109712983、109715104、109710439、109705107、109718567、109712204）上調(diào)表達(dá)。

綜上，果實(shí)病部糖酵解、TCA和氧化磷酸化過程相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，與果實(shí)發(fā)病呈正相關(guān)。

2.5""植物應(yīng)對外界環(huán)境的信號通路

MAPK主要與植物應(yīng)對外界環(huán)境刺激和植物激素有關(guān)。幾丁質(zhì)酶可以參與植物發(fā)育調(diào)控和抗病性，IB"vs"WT幾丁質(zhì)酶基因（109713885）表達(dá)量上升；蛋白激酶參與調(diào)節(jié)機(jī)體復(fù)雜功能，絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶基因（109726387、109726511）顯著上調(diào)；過氧化氫酶基因（catalase，"CAT）（109707674）顯著下調(diào)表達(dá)（圖6A）。

植物激素主要包括乙烯（ethylene，"EI）、生長素（auxin，"IAA）、赤霉素（gibberellin，"GA）、脫落酸（abscisic"acid，"ABA）。研究已經(jīng)表明植物激素代謝和相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)可能與褐變有關(guān)[32]。且研究發(fā)現(xiàn)脫落酸和赤霉素與植物褐變紊亂過程相關(guān)[33]。類脫落酸受體基因PYL5（109727857）顯著上調(diào)，表明在果實(shí)病部感受ABA信號增強(qiáng)，會促進(jìn)下游基因表達(dá)，開啟ABA信號通路，調(diào)控植物抗逆性（圖6B）。

研究發(fā)現(xiàn)活性氧（ROS）與植物病原相互作用有關(guān)[34]，并且可能與黑心病發(fā)生相關(guān)。類致病相關(guān)蛋白基因PRB1-3（109715689）顯著上調(diào)表達(dá)，類抗病蛋白基因RPM1（109715970）下調(diào)表達(dá)，表明果實(shí)發(fā)病后ROS增加，但呼吸爆發(fā)氧會消除ROS對細(xì)胞產(chǎn)生的毒害作用，呼吸爆發(fā)氧化酶同源蛋白（A、B、C和E）基因（109717636、109728108、109722976、109704560）都上調(diào)表達(dá)。其次，當(dāng)植物細(xì)胞受到外界刺激后，機(jī)體會產(chǎn)生熱休克蛋白來抵抗壓力，熱休克蛋白基因（109721392、109728698、109727398）下調(diào)表達(dá)；WRKY家族基因和植物抗性有關(guān)，當(dāng)植物受到外界壓力刺激后該家族基因會大量表達(dá)，轉(zhuǎn)錄因子WRKY26基因（109709450）上調(diào)表達(dá)；鈣是一種細(xì)胞膜上的次級調(diào)節(jié)分子，類鈣調(diào)素基因（109713066、109726233）也顯著上調(diào)表達(dá)，表明機(jī)體在果實(shí)發(fā)病后會啟動鈣離子調(diào)節(jié)系統(tǒng)（圖6C）。

2.6""抗氧化物質(zhì)相關(guān)通路分析

次生代謝苯丙烷生物合成途徑是酚類和黃酮類化合物等抗氧化物質(zhì)合成途徑，可抑制果實(shí)褐變。4-香豆酸-CoA連接酶參與催化類黃酮物質(zhì)合成，其相關(guān)基因（109711909、109720819、109711565、109713679、109713578）上調(diào)表達(dá)，可能會加快催化類黃酮物質(zhì)的合成（圖7A）；黃酮和異黃酮都是黃酮類化合物，都屬于抗氧化物質(zhì)。查爾酮合成酶（chalcone"synthase，"CHS）是將苯丙烷代謝途徑引向黃酮類化合物的合成第一關(guān)鍵酶，但是CHS基因表達(dá)下調(diào)，可能影響類黃酮的生物合成。查爾酮異構(gòu)化酶（chalcone"isomerase，"CHI）是進(jìn)入異黃酮代謝的關(guān)鍵酶，CHI基因（109719166、109719641）上調(diào)表達(dá)，其基因表達(dá)量升高（圖7C）。苯丙氨酸解氨酶（pheny lalanine"ammonia-lyase，"PAL）是酚類物質(zhì)合成的相關(guān)酶，PAL基因109727686顯著下調(diào)表達(dá)，而109713835上調(diào)表達(dá)，但下調(diào)基因FPKM值遠(yuǎn)大于上調(diào)基因（圖7A）。過氧化物酶（peroxidase，"POD）基因中既有上調(diào)基因，也有下調(diào)基因（圖7A），研究發(fā)現(xiàn)POD是一個雙向酶，既可氧化[35]，又可抗氧化[36]。

谷胱甘肽是一種還原劑，參與機(jī)體氧化還原反應(yīng)，抑制果實(shí)褐變。γ-谷氨酰環(huán)化轉(zhuǎn)移酶基因（109725671、109724587）上調(diào)表達(dá)，而5-氧代脯氨酸酶基因（109708431）下調(diào)表達(dá)，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因（109708663）下調(diào)表達(dá)（圖7B），果實(shí)發(fā)病后谷胱甘肽合成途徑上相關(guān)酶基因表達(dá)量降低。

抗壞血酸是一種抗氧化物質(zhì)，可抑制黑心病的發(fā)生。菠蘿果實(shí)中抗壞血酸含量豐富，為47.8"mg/100"g[30]，對抗壞血酸和醛酸代謝變化分析，發(fā)現(xiàn)L-抗壞血酸過氧化物酶（L-ascorbate"peroxidase，"APX）基因（109727824）顯著下調(diào)表達(dá)，而且L-抗壞血酸氧化酶（L-ascorbate"oxidase，"AOX）同系物（109719227）顯著上調(diào)表達(dá)（圖7D），可能病部果實(shí)抗氧化酶能力下降。

2.7""不同通路關(guān)鍵基因表達(dá)分析

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從不同路徑中篩選共30個關(guān)鍵基因，通過RT-qPCR對果實(shí)病部和健部果實(shí)的30個基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析。結(jié)果表明，糖代謝路徑中TCA循環(huán)、丙酮酸代謝和氧化磷酸化關(guān)鍵基因在果實(shí)病部均顯著上調(diào)表達(dá)（圖8A），表明果實(shí)發(fā)病后機(jī)體能量代謝旺盛。MAPK信號通路中蘇氨酸蛋白激酶、致病蛋白脫落酸受體基因在果實(shí)病部顯著上調(diào)表達(dá)，而抗性基因（如抗病基因和過氧化氫酶）顯著下調(diào)表達(dá)（圖8B）?？寡趸房寡趸窹AL和APX在病部顯著下調(diào)表達(dá)，氧化酶AOX顯著上調(diào)表達(dá)（圖8C），表明果實(shí)發(fā)病后的抗病能力下降。這些結(jié)果也與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。

2.8""黑心病路徑分析

菠蘿果實(shí)內(nèi)部容易發(fā)生黑心病，而且其發(fā)生是由多種原因造成的，通過RNA-Seq分析得到黑心病可能與多個代謝通路有關(guān)。當(dāng)早期果實(shí)受到外界刺激時，可誘導(dǎo)呼吸爆發(fā)氧化酶和熱激蛋白進(jìn)行抵抗；發(fā)病后果實(shí)病部致病相關(guān)的蛋白基因顯著上調(diào)表達(dá)，抗病蛋白基因顯著下調(diào)表達(dá)，可導(dǎo)致果實(shí)內(nèi)部ROS增加，但MAPK途徑可以通過調(diào)節(jié)幾丁質(zhì)酶、蛋白激酶和過氧化氫酶來抑制ROS產(chǎn)生；轉(zhuǎn)錄因子WRKY可調(diào)節(jié)細(xì)胞膜上的Ca2+信號通路；菠蘿果實(shí)糖含量高，發(fā)病后糖代謝在有氧和無氧條件下相關(guān)基因表達(dá)顯著升高；脫落酸受體基因表達(dá)顯著升高，促進(jìn)下游基因表達(dá)，調(diào)控果實(shí)抗逆性；抗氧化通路中合成黃酮相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，但是異黃酮相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)；合成谷胱甘肽相關(guān)基因下調(diào)，抗壞血酸和醛酸代謝通路中生成APX的相關(guān)基因顯著下調(diào)表達(dá)，而AOX的相關(guān)基因顯著上調(diào)表達(dá)（圖9）。

3""討論

本研究通過RNA-Seq分析菠蘿黑心病發(fā)病的差異基因，獲得參與菠蘿黑心病發(fā)病基因的基因網(wǎng)絡(luò)，篩選出菠蘿黑心病相關(guān)的候選基因，以通過分子生物手段改善菠蘿黑心病。

3.1""糖代謝的生物氧化3個過程通路

有研究表明，荔枝在成熟過程中會產(chǎn)生大量乙醛和乙酸，加速發(fā)酵過程[37]。通過糖酵解分析可知，糖酵解在無氧條件下生成乙醛和乙酸的酶表達(dá)量升高，有氧條件下糖酵解生成的丙酮酸可以進(jìn)入TCA循環(huán)，同樣TCA過程中關(guān)鍵酶基因表達(dá)量顯著上調(diào)，同時果實(shí)發(fā)病后氧化磷酸化途徑中多種酶基因表達(dá)量也發(fā)生顯著上調(diào)，說明果實(shí)發(fā)病后植物細(xì)胞代謝加快，需要更多的能量。

3.2""植物應(yīng)對外界環(huán)境的信號通路

MAPK途徑與植物體免疫、應(yīng)對環(huán)境壓力和正常的生長發(fā)育[38-40]有關(guān)。果實(shí)發(fā)生黑心病后，抗性酶基因表達(dá)量顯著下調(diào)。類脫落酸受體基因PYL5表達(dá)量顯著升高，可能會調(diào)控植物抗逆性。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體會在早期大量表達(dá)熱休克蛋白和呼吸爆發(fā)氧化酶來抵抗外界刺激[41-42]，菠蘿病部致病蛋白基因顯著上調(diào)表達(dá)。

3.3""抗氧化物質(zhì)相關(guān)通路

果實(shí)品質(zhì)劣變與抗氧化物質(zhì)含量有關(guān)，鮮切茄子褐變會使抗氧化物質(zhì)GSH、ASA含量降低[43]。果實(shí)發(fā)病后，抗氧化物質(zhì)代謝通路谷胱甘肽合成基因表達(dá)下調(diào)，黃酮生物合成途徑基因下調(diào)表達(dá)，L-抗壞血酸過氧化物酶（APX）基因顯著下調(diào)表達(dá)，但L-抗壞血酸氧化酶同系物基因顯著上調(diào)表達(dá)，總體來說，果實(shí)發(fā)病后相關(guān)抗氧化物質(zhì)基因表達(dá)量降低，但氧化性物質(zhì)基因表達(dá)量升高，這將會使果實(shí)衰老加速，病情惡化。

綜上所述，本研究從RNA-Seq數(shù)據(jù)中選擇3個與菠蘿黑心病相關(guān)的路徑，對其差異進(jìn)行聚類和定量驗(yàn)證分析，發(fā)現(xiàn)菠蘿果實(shí)發(fā)病后，病部糖酵解、TCA和生物氧化過程相關(guān)基因表達(dá)量顯著上調(diào)、抗性蛋白基因表達(dá)顯著下調(diào)，致病蛋白基因表達(dá)顯著上調(diào)，抗氧化相關(guān)酶基因表達(dá)顯著下調(diào)，氧化酶基因表達(dá)顯著上調(diào)。通過上述分析可以選擇與黑心病相關(guān)的候選基因，以豐富菠蘿黑心病的基因網(wǎng)絡(luò)。

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