間座殼屬產(chǎn)植物激素、有機(jī)酸和脂肪酸分析研究

摘""要：間座殼屬（Diaporthe）真菌是一類重要的植物病原真菌、內(nèi)生菌及腐生菌，廣泛分布于生態(tài)系統(tǒng)中。本研究利用LC-MS和GC-MS法測(cè)定16株間座殼屬產(chǎn)植物激素、有機(jī)酸和脂肪酸的種類及產(chǎn)量，并通過(guò)Ward法聚類分析對(duì)不同菌株進(jìn)行品質(zhì)類型的分類。結(jié)果表明：16株菌株中均能檢測(cè)到4種植物激素、3種有機(jī)酸和5種脂肪酸。植物激素分別為脫落酸（ABA，平均產(chǎn)量125.36"μg/kg）、吲哚乙酸（IAA，平均產(chǎn)量40.28"μg/kg）、水楊酸（SA，平均產(chǎn)量6.63"μg/kg）和茉莉酸（JA，平均產(chǎn)量4.95"μg/kg），ABA的產(chǎn)量明顯高于其他植物激素。有機(jī)酸為琥珀酸（平均產(chǎn)量336.04"μg/g）、維生素C（Vc，平均產(chǎn)量10.03"μg/g）和莽草酸（平均產(chǎn)量0.58"μg/g），其中琥珀酸產(chǎn)量明顯高于其他有機(jī)酸。脂肪酸分別為反亞油酸（平均產(chǎn)量58.99"μg/g）、亞麻酸（平均產(chǎn)量28.15"μg/g）、硬脂酸（平均產(chǎn)量21.35"μg/g）、棕櫚酸（平均產(chǎn)量17.07"μg/g）和油酸（平均產(chǎn)量15.22"μg/g）。利用植物激素、有機(jī)酸和脂肪酸累積狀況對(duì)16株間座殼屬分別進(jìn)行聚類分析，均把D."biconispora"D43菌株單獨(dú)歸為一個(gè)類群，該菌株的ABA（443.86"μg/kg）、琥珀酸（1115.98"μg/g）、莽草酸（1.21"μg/g）和油酸（60.75"μg/g）的產(chǎn)量均最高，而反亞油酸產(chǎn)量（7.08"μg/g）最低。綜合分析認(rèn)為D."biconispora"D43菌株在琥珀酸的開(kāi)發(fā)利用方面具有一定潛力。研究結(jié)果為間座殼屬真菌在食品、化工等領(lǐng)域的研發(fā)和應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：間座殼屬；植物激素；有機(jī)酸；脂肪酸中圖分類號(hào)：R284""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Production"of"Phytohormones，"Organic"Acids"and"Fatty"Acids"by"Diaporthe"Fungi

WANG"Shumin1，2，"SUN"Jinhua1，"GONG"Deqiang1，"CHEN"Gengxin3，"LI"Min1*，"HU"Meijiao1*

1."Environment"and"Plant"Protection"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Haikou，"Hainan"571101，"China;"2."School"of"Life"Sciences，"Hainan"University，"Haikou，"Hainan"570228，"China;"3."School"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University，"Danzhou，"Hainan"571737，"China

Abstract："Species"of"Diaporthe"have"broad"host"ranges"and"are"widely"distributed"in"ecosystems，"occurring"as"plant"pathogens，"endophytes"or"saprobes."In"this"study，"the"ingredients"and"contents"of"phytohormones，"organic"acids，"and"fatty"acids"in"16"strains"of"Diporthe"fungi，"collected"and"identified"from"Xisha"islands，"were"detected"by"LC-MS"and"GC-MS"methods."Cluster"analysis"by"Ward"method"of"Euclid"Distance"was"used"to"classify"the"quality"types"of"different"strains."The"results"showed"that"four"phytohormones，"three"organic"acids，"and"five"fatty"acids"could"be"detected."The"phytohormones"included"abscisic"acid"（ABA，"average"yield"125.36"μg/kg），"indole-3-acetic"acid"（IAA，"average"yield"40.28"μg/kg），"salicylic"acid"（SA，"average"yield"6.63"μg/kg）"and"jasmonic"acid"（JA，"average"yield"4.95"μg/kg）."the"yield"of"ABA"was"significantly"higher"than"other"plant"hormones，"and"the"four"phytohormones"contents"of"different"strains"varied"greatly."Organic"acids"were"succinic"acid"（average"yield"336.04"μg/g），"succinic"acid"（Vc，"average"yield"10.03"μg/g），"shikimic"acid"（average"yield"0.58"μg/g）."The"succinic"acid"production"of"Diporthe"fungus"was"significantly"higher"than"those"of"other"organic"acids."The"yield"of"organic"acids"varied"greatly"among"the"16"strains."The"fatty"acids"were"trans"linoleic"acid"（average"yield"58.99"μg/g），"linolenic"acid"（average"yield"28.15"μg/g），"stearic"acid"（average"yield"21.35"μg/g），"palmitic"acid"（average"yield"17.07"μg/g）"and"oleic"acid"（average"yield"15.22"μg/g）."The"production"of"trans"linoleic"acid"were"the"highest，"while"the"production"of"oleic"acid"the"lowest，"and"the"five"organic"acids"contents"of"different"strains"varied"remarkably."Cluster"analysis"using"plant"hormones，"organic"acids，"and"fatty"acids"of"the"16"strains"revealed"D."biconispora"D43"was"independent"group."The"strain"showed"the"highest"production"of"ABA"（average"yield"443.86"μg/kg），"succinic"acid"（average"yield"1115.98"μg/g），"shikimic"acid"（average"yield"1.21"μg/g），"and"oleic"acid"（average"yield"60.75"μg/g），"while"the"lowest"production"of"linoleic"acid"（average"yield"7.08"μg/g）."Comprehensive"analysis"suggests"that"D."biconispora"D43"had"certain"potential"for"the"development"and"utilization"of"microbial"derived"succinic"acid."This"study"would"provide"information"for"the"research"and"appication"of"Diaporthe"resources"in"the"field"of"food，"chemical"industry，"and"other"related"fields.

Keywords："Diaporthe;"phytohormones;"organic"acids;"fatty"acids

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.11.022

間座殼屬（Diaporthe）于1870年由NITSCHKE建立，屬子囊菌門（Ascomycota）類売菌綱（Sordariomycetes）間座殼目（Diaporthales）間座殼科（Diapoithaceae）真菌。SACCARDO于1883年提出了擬莖點(diǎn)霉（Phomopsis）為間座殼屬的無(wú)性階段。2011年，墨爾本命名法會(huì)議上通過(guò)《國(guó)際藻類、菌物和植物命名法規(guī)》（ICN），會(huì)議決定采用“一菌一名”的單一命名法[1]。間座殼屬取得了該屬命名權(quán)。該屬地理分布廣，寄主種類多，在自然生態(tài)系統(tǒng)中占有極為重要的地位[2]。該屬引起多種作物、觀賞植物和林木病害，是重要的植物病原真菌，同時(shí)也是植物的內(nèi)生菌和腐生菌[3-8]。研究表明間座殼屬具有復(fù)雜和發(fā)達(dá)的次生代謝能力[9-10]，已鑒定的次生代謝產(chǎn)物中包含有聚酮類、生物堿類、萜類、肽、蒽醌類及其他類型結(jié)構(gòu)化合物，大多具有抗腫瘤、殺菌、殺寄生蟲(chóng)、抗高脂血癥、抗氧化等生物活性[9-11]，為新型藥物開(kāi)發(fā)和生物合成提供了重要資源。然而對(duì)其發(fā)酵分泌的其他代謝產(chǎn)物，如有機(jī)酸、脂肪酸和植物激素等方面的研究和利用鮮有報(bào)道。2018—2023年，筆者在進(jìn)行西沙群島微生物資源調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，調(diào)查的22個(gè)島礁中，從12個(gè)島礁的33種植物中均發(fā)現(xiàn)該屬菌株，共鑒定保存該屬真菌80余株。表明間座殼屬真菌廣泛分布于西沙群島的植物群落中，是我國(guó)熱帶島礁特殊生境中一類重要的真菌資源，亦是構(gòu)成生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分[12]。本研究選取采集鑒定的16個(gè)代表性間座殼屬菌株，分別測(cè)定其植物激素、有機(jī)酸和脂肪酸等分泌情況，比較分析不同菌株間的化合物種類及含量差異等，旨在探討其在食品、化工等領(lǐng)域的應(yīng)用潛能，為挖掘新的有益真菌資源提供研究基礎(chǔ)。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""供試菌株""16株供試菌株由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所分離、鑒定、保存，菌株具體信息見(jiàn)表1。

1.1.2""試劑""馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，草酸、磷酸二氫銨、磷酸、氫氧化鉀、甲酸、氯仿、乙酸乙酯、石油醚和甲醇（色譜純）用于樣品處理和指標(biāo)測(cè)定。

1.1.3""主要儀器設(shè)備""臺(tái)式冷凍離心機(jī)（型號(hào)：Eppendorf"5810R，艾本德股份公司）。高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀（液相色譜儀型號(hào)：ACQUITY"UPLC"I-Class，三重四極桿質(zhì)譜儀型號(hào)：Waters"Xevo"TQ-S"micro，美國(guó)沃特世有限公司）。高效液相色譜儀（型號(hào)：Waters"e2695+PDA"2998，美國(guó)沃特世有限公司）。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（型號(hào)7890A-5975C，美國(guó)安捷倫科技公司）。

1.2""方法

1.2.1""菌株樣品的處理""將待測(cè)16株菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，于25"℃培養(yǎng)4"d，用無(wú)菌打孔器在菌落邊緣打制4個(gè)菌餅（d=5"mm），將其放入裝有100"mL馬鈴薯葡萄糖（PDB）液體培養(yǎng)基的250"mL錐形瓶中，置于28"℃，180"r/min恒溫?fù)u床中發(fā)酵培養(yǎng)7"d。雙層紗布過(guò)濾，收集菌絲體，將其放入研缽中，加入液氮充分研磨至粉末狀，再分裝至離心管中，置于–80"℃，備用。

1.2.2""激素種類和含量檢測(cè)""稱取"0.5"g菌絲樣品至10"mL離心管中，加入3"mL預(yù)冷的80%甲醇混勻，勻漿液在渦旋儀2500"r/min渦旋1"min，4"℃萃取24"h后，離心機(jī)預(yù)冷至4"℃，以8000"r/min"離心10"min。利用注射器取其上清液1"mL，用0.22"μm濾膜過(guò)濾至1.5"mL進(jìn)樣瓶中。設(shè)置3組重復(fù)，以PDB培養(yǎng)基作對(duì)照。

液相色譜條件：采用ACQUITY"UPLC"BEH"Shield"RP18色譜柱（2.1"mm×50"mm，"1.7"μm），進(jìn)樣量2"μL，流動(dòng)相A為0.1%甲酸水，B為甲醇，流速為0.2"mL/min進(jìn)行洗脫，柱溫37"℃，運(yùn)行時(shí)間8"min。質(zhì)譜條件：離子源溫度為120"℃，脫溶劑氣溫度為380"℃，毛細(xì)管電壓為2.0"kV，錐孔氣流速為60"L/h，脫溶劑氣流速600"L/h，碰撞氣流速0.18"mL/min，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple"reaction"monitoring，"MRM）檢測(cè)方法。

定量分析：以茉莉酸甲酯（MeJA）、茉莉酸（JA）、赤霉素（GA3）、吲哚乙酸（IAA）、脫落酸（ABA）、玉米素（ZT）和水楊酸（SA）為標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司），通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間和峰面積進(jìn)行比較，定量分析樣品中激素種類和含量。

1.2.3""有機(jī)酸種類和含量檢測(cè)""稱取1"g菌絲樣品至10"mL離心管中，加入3"mL"0.05%草酸提取30"min，置于離心機(jī)中，以10000"r/min，離心5"min后，利用無(wú)菌注射器取其上清液1"mL，通過(guò)0.22"μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾至1.5"mL進(jìn)樣瓶中。設(shè)置3組重復(fù)，以PDB培養(yǎng)基作對(duì)照。

液相色譜條件：色譜柱Agilent"C18（4.6"mm×"250"mm×5"μm）。柱溫為室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)為210"nm，進(jìn)樣量為10"μL。流動(dòng)相為5%磷酸二氫銨，用磷酸調(diào)pH為2.1。

定量分析：以檸檬酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸、酒石酸、奎寧酸、莽草酸、Vc為標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司）。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間和峰面積進(jìn)行比較，定量分析樣品中有機(jī)酸種類和含量。

1.2.4""脂肪酸種類和含量檢測(cè)""稱取0.5"g菌絲樣品移入2"mL離心管中，加入1"mL石油醚-乙醚混合液，加入0.5"mL氫氧化鉀-甲醇溶液進(jìn)行脂肪酸甲酯化；渦旋振蕩，靜止反應(yīng)1"h；再次渦旋振蕩，加入1"mL去離子水；靜置30"min分層，以4500"r/min離心2"min，上清液經(jīng)0.22"μm有機(jī)濾膜過(guò)濾。設(shè)置3組重復(fù)，以PDB培養(yǎng)基作對(duì)照。

氣相色譜條件：安捷倫毛細(xì)管柱DB-225MS（30"m×0.25"mm×0.25"μm），恒定流速1"mL/min，進(jìn)樣口溫度為280"℃，進(jìn)樣量為1"μL，分流比為2∶1。升溫程序：初始溫度為50"℃，保持1"min；以5"℃/min升溫至200"℃，以2"℃/min升溫至230"℃，保持10"min。傳輸線溫度為280nbsp;℃，離子源溫度為230"℃，四極桿溫度為150"℃，電離方式為EI源，電離能量為70"eV，溶劑延遲2"min。

定量分析：以棕櫚酸甲酯、棕櫚油酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、反亞油酸甲酯、亞油酸甲酯等35種化合物為標(biāo)準(zhǔn)品（NU-CHEK，美國(guó)紐雀客有限公司）。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間和峰面積進(jìn)行比較，定量分析樣品中脂肪酸種類和含量。

1.3""數(shù)據(jù)處理

利用Excel"2007軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、統(tǒng)計(jì)，使用IBM"SPSS"25.0軟件進(jìn)行多重比較和聚類分析。

2""結(jié)果與分析

2.1""間座殼屬真菌產(chǎn)植物激素分析

通過(guò)檢測(cè)表明，16個(gè)菌株的菌絲體均能檢測(cè)到ABA、IAA、JA和SA"4種植物激素。根據(jù)植物激素標(biāo)品的線性回歸方程（表2），得出16個(gè)菌株植物激素含量（表3）。各植物激素平均含量排序?yàn)锳BA（125.36"μg/kg）gt;IAA（40.28"μg/kg）gt;SA（6.63"μg/kg）gt;JA（4.95"μg/kg）。不同菌株菌絲體的ABA含量差異較大，其變異系數(shù)達(dá)到0.72。其中，D43菌株含量最高，為443.86"μg/kg，顯著高于其他菌株；其次是D44菌株，產(chǎn)量為153.28"μg/kg，其余14個(gè)菌株菌絲體的ABA含量均較低，在57.66～143.82"μg/kg之間。不同菌株菌絲體的IAA含量差異大，其變異系數(shù)達(dá)到1.26。其中D44菌株含量最高，為185.72"μg/kg，顯著高于其他菌株；其次是D45菌株，IAA含量為143.54"μg/kg；其余菌株的IAA含量較低，在1.43～"55.31"μg/kg之間。不同菌株菌絲體中的JA含量不同，其變異系數(shù)為0.33。D40的JA含量最高，含量為8.70"μg/kg，顯著高于其他菌株；D42菌株的JA含量最低，僅為2.15"μg/kg。不同菌株菌絲體的SA含量不同，其變異系數(shù)為0.55。其中D40和D29的SA產(chǎn)量較高，分別為12.95、12.72"μg/kg，顯著高于其他菌株；D14含量最低，為1.04"μg/kg。

2.2""間座殼屬真菌產(chǎn)有機(jī)酸分析

通過(guò)測(cè)定間座殼屬產(chǎn)有機(jī)酸情況，結(jié)果表明，16株菌的菌絲體中均檢測(cè)到琥珀酸、Vc和莽草酸3種有機(jī)酸。根據(jù)標(biāo)品的線性回歸方程（表4），得出16個(gè)菌株各有機(jī)酸含量（表5）。按照平均含量排序?yàn)殓晁幔?36.04"μg/g）gt;Vc（10.03"μg/g）gt;莽草酸（0.58"μg/g）。琥珀酸的含量明顯高于Vc和莽草酸。不同菌株菌絲體間的琥珀酸含量差異較大，其變異系數(shù)達(dá)到0.73。其中，D43的琥珀酸含量最高，平均含量為1115.98"μg/g，顯著高于其他菌株；其次是D37、D46和D15，其含量分別為565.80、459.52、435.89"μg/g。不同菌株菌絲體間的Vc含量差異也較大，其變異系數(shù)達(dá)到0.71。其中，D46的Vc含量最高，為26.42"μg/g，顯著高于其他菌株；其次是D37菌株，Vc含量為24.21"μg/g，其余菌株的Vc含量均較低，在3.97～"17.00"μg/g之間。不同菌株菌絲體中的莽草酸含量不同，其變異系數(shù)為0.46。其中，D43的莽草酸含量最高，為1.21"μg/g，顯著高于其他菌株。

2.3""間座殼屬真菌產(chǎn)脂肪酸分析

通過(guò)測(cè)定表明，供試的16株菌絲體中均能檢測(cè)到棕櫚酸、硬脂酸、油酸、反亞油酸和亞麻酸5種脂肪酸。根據(jù)標(biāo)品的線性回歸方程（表6），計(jì)算出16個(gè)菌株各脂肪酸含量（表7）。按產(chǎn)量平均值排序?yàn)榉磥営退幔?8.99"μg/g）gt;亞麻酸（28.15"μg/g）gt;硬脂酸（21.35"μg/g）gt;棕櫚酸（17.07"μg/g）gt;油酸（15.22"μg/g）。16個(gè)菌株的反亞油酸含量差異大，其變異系數(shù)達(dá)到0.52。其中，D15含量最高，為146.13"μg/g，顯著高于其他菌株；菌株D43含量最低，為7.08"μg/g，顯著低于其他15個(gè)菌株。不同菌株的亞麻酸含量差異明顯，其變異系數(shù)達(dá)到0.58。其中，D37的亞麻酸含量最高，為70.91"μg/g，顯著高于其他菌株；其次為D14和D40，含量分別為51.63"μg/g和51.51"μg/g。不同菌株的硬脂酸含量不同，其變異系數(shù)為0.67。D30和D29含量較高，分別為52.87"μg/g和52.70"μg/g，顯著高于其他菌株。16個(gè)菌株的棕櫚酸含量差異較大，其變異系數(shù)達(dá)到0.93，D15的棕櫚酸含量最高，為61.60"μg/g，其次是D27（48.18"μg/g），其余菌株的棕櫚酸含量較低，在4.95～35.85"μg/g之間。不同菌株的油酸含量不同，其變異系數(shù)為1.02。其中，D43的油酸含量最高，為60.75"μg/g，顯著高于其他菌株；其次為D29，油酸產(chǎn)量為42.71"μg/g。

2.4""基于植物激素、有機(jī)酸、脂肪酸產(chǎn)量的聚類分析

利用16個(gè)間座殼屬真菌菌株的植物激素、有機(jī)酸和脂肪酸產(chǎn)量，按照系統(tǒng)聚類的歐氏距離Ward法分別進(jìn)行系統(tǒng)聚類?；谥参锛に禺a(chǎn)量的聚類結(jié)果表明，在遺傳距離為2.3處，可將16個(gè)菌株分為3個(gè)類群，其中，菌株D43單獨(dú)聚為一支，菌株D44和D45聚為一支，其他13個(gè)菌株聚為一支（圖1）?；谟袡C(jī)酸產(chǎn)量的聚類結(jié)果表明，在遺傳距離為1.5處，可將16個(gè)菌株分為3個(gè)類群，菌株D43單獨(dú)為一支，菌株D15、D37和D46聚為一支，其他12個(gè)菌株聚為一支（圖2）?；谥舅岙a(chǎn)量的聚類結(jié)果表明，在遺傳距離為8.5處，可將16個(gè)菌株分為4個(gè)類群，其中菌株D43仍單獨(dú)聚為一支，菌株D27單獨(dú)聚為一支，D14和D37聚為一支，其他12個(gè)菌株聚為一支（圖3）。

3""討論

微生物發(fā)酵廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，給人類生活和工業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了巨大改變。發(fā)酵制劑包括如植物激素、有機(jī)酸、脂肪酸、增稠劑、凝膠劑、增味劑、酶、風(fēng)味化合物、維生素、必需氨基酸、食用色素等[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)真菌都可以產(chǎn)生植物激素。如藤倉(cāng)鐮刀菌（Fusarium"fujikuroi）通過(guò)分泌赤霉素（GA3）引起水稻惡苗病，被廣泛應(yīng)用于GA3的工業(yè)生產(chǎn)[15]?？煽擅撸↙asiodiplodia"theobromae）發(fā)酵可以生產(chǎn)大量JA，且產(chǎn)能遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于植物[16-17]。近30年來(lái)，研究者一直致力于利用微生物發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生天然ABA，以滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求。研究發(fā)現(xiàn)灰葡萄孢（Botrytis"cinerea）攜帶一個(gè)ABA生物合成基因簇[18]，當(dāng)前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了灰葡萄孢工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)天然ABA[19]。此外，有報(bào)道可可毛色二孢產(chǎn)植物激素的種類，認(rèn)為該菌不僅可以大量產(chǎn)生JA，在其菌絲中還能檢測(cè)到GA3、ABA、SA和TZ等植物激素[20]。本研究測(cè)定了間座殼屬16個(gè)菌株分泌茉莉酸甲酯（MeJA）、JA、GA3、ABA、ZT、SA等植物激素的能力，發(fā)現(xiàn)間座殼屬真菌可以分泌4種植物激素，其中ABA的平均產(chǎn)量相對(duì)最高，但該屬真菌的植物激素水平總體較低。

大多數(shù)有機(jī)酸可通過(guò)微生物發(fā)酵進(jìn)行生產(chǎn)，其中實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的有檸檬酸、葡萄糖酸、乳酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸等[21]。黑曲霉（Aspergillus"inger）已經(jīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)檸檬酸、葡萄糖酸[14]。乳酸菌（Lactobacillus）是乳酸的主要生產(chǎn)菌。蘋(píng)果酸的主要生產(chǎn)菌是酪丁酸梭菌（C."tyrobutyricum）、S."cerevisiae、大腸桿菌（E."coli）等[22]。琥珀酸的發(fā)酵微生物多來(lái)源于產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌（Mannheimia"succiniciproducens）[23]、大腸桿菌、琥珀酸放線桿菌（Actinobacillus"succinogenes）[24]以及解脂耶氏酵母（Yarrowia"lipolytica）、釀酒酵母（Saccharomyces"cerevisiae）[25]和畢赤酵母（Pichia"kudriavzevii）[26]等。GUETTLER等[27]從牛瘤胃中分離篩選出1株琥珀酸放線桿菌菌株，琥珀酸產(chǎn)量達(dá)到70.0"g/L。黃超等[28]以大腸桿菌SUC37為出發(fā)菌株，通過(guò)Red同源重組技術(shù)，構(gòu)建乳酸脫氫酶基因（ldhA）失活突變株，琥珀酸產(chǎn)量達(dá)59.26"g/L。孫瑩[29]篩選到1株總狀枝毛霉（M."racemosus），琥珀酸產(chǎn)量達(dá)21.25"g/L。BABAEI等[25]構(gòu)建的工程菌解脂耶氏酵母ST8578的琥珀酸產(chǎn)量達(dá)35.3"g/L。絲狀真菌分泌較多的有機(jī)酸是蘋(píng)果酸和檸檬酸，本研究檢測(cè)了16個(gè)間座殼屬菌株的檸檬酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸、奎寧酸、莽草酸、Vc"6種有機(jī)酸的積累情況，發(fā)現(xiàn)16個(gè)菌株均能檢測(cè)到琥珀酸、莽草酸、Vc，琥珀酸的平均產(chǎn)量顯著高于Vc和莽草酸。其中D43菌株的琥珀酸產(chǎn)量達(dá)1115.98"μg/g，產(chǎn)量較高。針對(duì)該菌株的產(chǎn)酸特性，后續(xù)可開(kāi)展該菌株的誘變處理、發(fā)酵條件篩選及基因工程改造等研究，挖掘其產(chǎn)酸潛力。

脂肪酸是微生物細(xì)胞膜的重要組成部分，具有重要的生物學(xué)功能。用于生產(chǎn)脂肪酸的微生物種類主要有藻類、真菌和細(xì)菌。其中酵母和絲狀真菌含有豐富的脂肪酸種類[30-32]。主要包括棕櫚酸、油酸等，此外還可以生產(chǎn)多不飽和脂肪酸，如亞麻酸、亞油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸等。被孢霉（Mortierella）是最早研究并應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)亞油酸的菌種之一。M."viticola、卷枝毛霉（Mucor"circinelloides）、刺孢小克銀漢霉（Cunninghamella"echinulata）和雅致枝霉（Thamnidium"elegans）等絲狀真菌能夠積累亞麻酸[33]。青霉菌（Penicillium）、拉曼被孢霉（M."ramanniana）、深黃被孢霉（M."isabellina）和高山被孢霉（M."alpina）也可生產(chǎn)花生四烯酸[34]。裂殖壺菌（Schizochytrium"sp.）可生產(chǎn)二十二碳六烯酸[35]。本研究以棕櫚酸、油酸、亞麻酸、亞油酸等35種脂肪酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)16個(gè)間座殼屬菌株的脂肪酸積累情況進(jìn)行了研究。明確了間座殼屬真菌產(chǎn)油脂的種類。結(jié)果表明16個(gè)間座殼屬菌株均可以產(chǎn)生棕櫚酸、油酸、亞麻酸、硬脂酸和反亞油酸，其中反亞油酸的平均含量較高。反亞油酸具有損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞能力，還可能與炎癥因子的激活呈正相關(guān)[36]，該化合物還可對(duì)環(huán)境造成污染。間座殼屬真菌的反亞油酸的產(chǎn)量相對(duì)較低，對(duì)人體和環(huán)境的毒性風(fēng)險(xiǎn)較低。供試的16個(gè)菌株中，D43的反亞油酸產(chǎn)量最低，而油酸產(chǎn)量最高，表明在脂肪酸積累方面，該菌株表現(xiàn)出對(duì)人體和環(huán)境友好的特征。

通過(guò)對(duì)比基于脂肪酸的聚類分析和基于多基因序列的聚類分析結(jié)果（數(shù)據(jù)未列出），發(fā)現(xiàn)16株間座殼屬菌株通過(guò)上述2種方法聚類后，分類結(jié)果差異大。認(rèn)為間座殼屬種間鑒定的DNA分子特征和脂肪酸的分泌特征并不相符。這與早期研究認(rèn)為微生物脂肪酸的含量和結(jié)構(gòu)具有種屬特征，可以作為生物標(biāo)記來(lái)輔助鑒定菌種[37]的結(jié)論不盡相同。本研究還基于植物激素、有機(jī)酸和脂肪酸種類和產(chǎn)量對(duì)16株間座殼屬菌株進(jìn)行聚類分析，以期比較不同菌株的品質(zhì)類型，發(fā)現(xiàn)D43均單獨(dú)聚為一個(gè)類群，說(shuō)明該菌株根據(jù)上述品質(zhì)分類時(shí)表現(xiàn)特別。進(jìn)一步綜合分析發(fā)現(xiàn)，該菌株的ABA、琥珀酸、莽草酸及油酸產(chǎn)量均最高，且反亞油酸產(chǎn)量最低。認(rèn)為該菌株在琥珀酸的開(kāi)發(fā)利用方面具有一定潛力。

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