FISH技術(shù)在生物冶金中的應(yīng)用

王利沙 李平 趙洪俠

摘要：微生物種類(lèi)在生物冶金的過(guò)程中具有重要的作用，但是傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法已不能滿(mǎn)足于生物冶金研究的需要，隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，熒光原位雜交（FISH）技術(shù)被越來(lái)越廣泛的使用。FISH技術(shù)是一種不依賴(lài)于培養(yǎng)的微生物檢測(cè)技術(shù)，具有高度安全性和敏捷性，主要用來(lái)檢測(cè)礦中微生物的形態(tài)、數(shù)量和空間分布情況的一種現(xiàn)代分子生物學(xué)方法。本文主要介紹了熒光原位雜交（FISH）技術(shù)的原理、主要試劑、實(shí)驗(yàn)儀器、浸礦菌的固定方法和原位雜交過(guò)程，同時(shí)對(duì)FISH技術(shù)在生物冶金中的應(yīng)用和前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：生物冶金 熒光原位雜交 環(huán)境微生物 浸礦菌

基金項(xiàng)目：基于FISH技術(shù)的細(xì)菌-硫鐵礦的吸附機(jī)制研究（項(xiàng)目編號(hào)：2021GX099）。

作者簡(jiǎn)介：王利沙（1984—），女，碩士，主要從事教學(xué)工作。

李平（1978—），女，碩士，主要從事教學(xué)工作。

趙洪俠（1986—），女，碩士，主要從事教學(xué)工作。

Application of Fish Technology in Bioleaching

WANG Lisha ?LI Ping ?ZHAO Hongxia

（Weifang Nursing Vocational College， Weifang， Shandong Province， 261000，China）

Abstract： Microbial species play an important role in the process of bioleaching， but the traditional culture methods can not meet the needs of bioleaching research. With the development of modern science and technology， fluorescence in situ hybridization （FISH） technology is more and more widely used. FISH technology is a microbial detection technology independent of culture， with high safety and agility. It is mainly used to detect the morphology， quantity and spatial distribution of microorganisms in mines. This paper mainly introduces the principle， main reagents， experimental instruments， fixation method of ore leaching bacteria and in situ hybridization process of FISH technology are introduced. At the same time， the application and prospect of FISH technology in bioleaching are prospected.

Key Words： Bioleaching; fluorescence in situ hybridization （FISH）; environmental microorganism; leaching bacteria

生物冶金是利用微生物技術(shù)通過(guò)多種反應(yīng)途徑對(duì)礦物進(jìn)行氧化分解，再進(jìn)行純化、富集、濃縮等，最終從礦物中浸出目標(biāo)金屬的過(guò)程，也是涉及冶金、生物、礦物等多學(xué)科的一種微生物冶金技術(shù)。該技術(shù)具有以下優(yōu)勢(shì)：反應(yīng)溫和、工藝過(guò)程簡(jiǎn)單、流程少、對(duì)環(huán)境友好、資源的利用率高等，因此被廣泛應(yīng)用在濕法冶金、環(huán)境工程、礦物加工等領(lǐng)域。目前，微生物冶金技術(shù)也面臨著一些問(wèn)題亟需解決，例如：微生物浸出過(guò)程的優(yōu)化與控制，在極端條件下對(duì)浸礦菌株的高效選育、生物冶金領(lǐng)域的拓展等。傳統(tǒng)的微生物冶金研究方法，容易忽略生物間的相互作用和氣候變化的影響，所得出的試驗(yàn)結(jié)果也不能真實(shí)的反映自然條件下微生物的空間分布、風(fēng)度和生物多樣性等，因此具有很大的局限性，也限制了我們對(duì)浸礦菌株的開(kāi)發(fā)和利用，因此亟需研究一種簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，對(duì)浸礦微生物進(jìn)行快速的鑒定和檢測(cè)。

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)微生物學(xué)方法相比，能夠有效地促進(jìn)和提高浸礦微生物的檢驗(yàn)精確度和微生物的種類(lèi)。隨著技術(shù)的發(fā)展，可以直接鑒定微生物的技術(shù)包括酶檢測(cè)技術(shù)、核酸探針檢測(cè)和免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)等，較為常用的分子生物技術(shù)包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)（RFLP）、X射線(xiàn)光電子能譜分析（XPS）、變性梯度凝膠電泳（DGGE）、熒光定量PCR技術(shù)和熒光原位雜交技術(shù)（FISH）等。其中FISH是一種不依懶于培養(yǎng)的非放射性的微生物檢測(cè)技術(shù)，由于該技術(shù)具有安全、探針?lè)€(wěn)定、準(zhǔn)確度和靈敏度高、雜交特異性好、能有多種顏色顯示等優(yōu)點(diǎn)，可以更加直觀地檢測(cè)出微生物在礦物表面的數(shù)量和分布，因此近年來(lái)在環(huán)境微生物學(xué)、濕法冶金技術(shù)研究領(lǐng)域逐漸被廣泛使用。該文主要對(duì)FISH在檢測(cè)礦物中的微生物技術(shù)作以簡(jiǎn)單介紹。

1 熒光原位雜交技術(shù)（FISH）簡(jiǎn)介

FISH技術(shù)具有高度的靈敏性、準(zhǔn)確的定位、比較短的試驗(yàn)周期及較強(qiáng)的特異性;FISH采用的是熒光探針，比較的穩(wěn)定且經(jīng)濟(jì);該技術(shù)采用高度靈敏度檢測(cè)儀器，如具有較高強(qiáng)度圖像的共焦激光掃描顯微鏡的使用，方便微生物計(jì)數(shù)的電荷耦合相機(jī)（CCD）和便于圖像數(shù)字化的圖像分析軟件，分析自動(dòng)化的流式細(xì)胞儀等，增加了FISH技術(shù)的高靈敏度分析能力。

FISH技術(shù)是采用熒光標(biāo)記的特異寡核苷酸序列作為探針，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，經(jīng)過(guò)變性、退火、變性過(guò)程，探針與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的靶RNA 分子或 DNA 分子的雜交，在熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描儀下通過(guò)觀察熒光的信號(hào)，來(lái)確定與特異探針雜交后微生物的形態(tài)、數(shù)量和分布。目前，F(xiàn)ISH技術(shù)主要采用高度保守的16S rRNA來(lái)設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)相應(yīng)菌株的原位檢測(cè)。采用rRNA來(lái)設(shè)計(jì)探針具有以下優(yōu)勢(shì)：（1）16S rRNA在微生物體內(nèi)具有很高的拷貝數(shù)，不同種類(lèi)的微生物的相對(duì)序列保守型不同，進(jìn)而設(shè)計(jì)特異性的探針，不同種、屬等水平上進(jìn)行熒光檢測(cè);（2）16S rRNA在微生物中分布廣泛且功能穩(wěn)定，可以極大的提高檢測(cè)的靈敏性。

2 ?FISH技術(shù)的相關(guān)步驟

2.1主要試劑

（1）PBS緩沖液：30mM?NaCl、7 mM?NaHPO4、3 mM?NaHPO，調(diào)節(jié)pH 為7.2.

（2）4%多聚甲醇溶液：加熱的33mL高純水，2g多聚甲醇，16.5mL的PBS緩沖液，室溫條件冷卻后，調(diào)節(jié)溶液pH為7.2。

（3）明膠溶液：明膠，KCr（SO）﹒12HO。

（4）DAPI復(fù)染液：1 g DAPI和1 mL滅菌雙蒸水配成溶液，低溫下保存。

（5）雜交溶液：1M?pH8.0的?Tris/HCl ，5M的NaCl溶液，10%的SDS溶液，雙蒸水和甲酰胺。注意：配制雜交液的時(shí)候，要根據(jù)雜交液中甲酰胺的百分含量。

（6））洗脫液：1M?pH8.0的?Tris/HCl ，5M的NaCl溶液，10%的SDS溶液，0.5M?EDTA，雙蒸水。注意：洗脫溶液中的NaCl溶液的濃度隨著雜交液中的甲酰胺濃度而發(fā)生相應(yīng)的變化。

2.2浸礦菌的固定

一般常用的固定方法為多聚甲醛固定法。取菌液100 mL，在4 ℃ 11 000 r/min離心8 min，棄上清液備用;再用滅過(guò)菌的PBS溶液洗滌菌液2次，棄去上清液后加入10 mL滅過(guò)菌的PBS溶液和30 mL 4%的多聚甲醛固定液制成菌體懸浮液，置于冰上固定3 h;4 ℃ 11 000 r/min離心8 min，棄上清液用30 mL滅過(guò)菌的PBS溶液洗滌、離心（11 000 r/min），再加入30 mL的PBS溶液和30 mL的在冰上預(yù)冷的乙醇制成菌體懸浮液;最后將處理好的菌體儲(chǔ)存在冰箱中（-20 ℃）備用。

2.3原位雜交

用移液槍吸取10 μL固定好的菌液加到經(jīng)明膠處理好的載玻片上，室溫下晾干;依次用50%，80%和96%的乙醇溶液洗滌、脫水，空氣中干燥，再將配置好的雜交液滴在載玻片上，并蓋蓋玻片，于46 ℃進(jìn)行雜交1.5～2.0 h;在黑暗條件下，用洗脫液進(jìn)行洗滌，并用DAPI溶液對(duì)菌液進(jìn)行復(fù)染，在室溫下晾干在熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡等進(jìn)行顯色觀察浸礦菌的形態(tài)、數(shù)量及分布。

2.4 注意事項(xiàng)

（1）在原位雜交技術(shù)中，要設(shè)計(jì)合適的、便于觀察的探針，因?yàn)樘结樀奶禺愋詫?huì)直接影響FISH技術(shù)的觀察結(jié)果。

（2）在處理微生物樣品的過(guò)程中，要進(jìn)行規(guī)范操作，微生物的固定、消毒滅菌、黑暗操作條件等要嚴(yán)格處理，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

（3）在用洗脫液對(duì)樣品進(jìn)行洗脫處理的時(shí)候，一定要掌握好時(shí)間和尺度，防止出現(xiàn)假陽(yáng)性或者假陰性，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.1在環(huán)境微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

FISH技術(shù)不需要培養(yǎng)所檢測(cè)的微生物樣品，可以直接檢測(cè)樣品中的微生物

種類(lèi)、分布，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)自然條件下的微生物進(jìn)行原位檢測(cè)，因此被官方應(yīng)用于環(huán)境微生物學(xué)的研究中。主要表現(xiàn)在以下兩個(gè)方面：（1）FISH技術(shù)在污水生物凈化方面的應(yīng)用。近年來(lái)，隨著我們對(duì)除磷、脫氮機(jī)理的深入研究，F(xiàn)ISH技術(shù)的引入解決了污水生態(tài)系統(tǒng)的微生物的適時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)、脫氮細(xì)菌和除磷菌的培養(yǎng)難等問(wèn)題。（2）在難降解有機(jī)物功能降解菌的研究。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者采用FISH技術(shù)成功客服了功能降解菌培養(yǎng)難的問(wèn)題，通過(guò)熒光（如FITC、Cy5等）標(biāo)記特異性探針，監(jiān)測(cè)反應(yīng)器中的好癢顆粒物機(jī)內(nèi)的微生物空間分布及種類(lèi)。

3.2在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用

由于FISH技術(shù)較高的敏感性和特異性，備受醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，能夠提早的發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞，并及時(shí)的進(jìn)行治療，大大提高了治療的成功率。例如：通過(guò)富集培養(yǎng)液基薄層細(xì)胞，并采用熒光原位雜交（FISH）技術(shù)來(lái)檢測(cè)尿路上皮癌具有重要的應(yīng)用價(jià)值，為臨床醫(yī)生的正確診斷提供參考。

3.3在生物冶金領(lǐng)域的應(yīng)用

FISH技術(shù)由于其自身的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，除了在環(huán)境微生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域之外，在生物冶金領(lǐng)域也備受青睞。例如：利用FISH技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（Q-PCR）能夠快速且準(zhǔn)確的檢測(cè)新疆鈾礦生物冶金中的細(xì)菌的數(shù)量、種類(lèi)和空間定位，進(jìn)而分析微生物群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化。采用FISH方法分析微生物與黃鐵礦的界面作用，通過(guò)專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)Acidithiobacillus ferrooxidans和Leptospirillum ferrooxidans的熒光探針，檢測(cè)黃鐵礦表面細(xì)菌的吸附情況和空間分布。

4 ?FISH技術(shù)在生物冶金中的應(yīng)用前景

近年來(lái)，隨著熒光原位雜交技術(shù)的高度特異性及其檢測(cè)結(jié)果的靈敏性，使得FISH檢測(cè)技術(shù)促使FISH技術(shù)在生物冶金領(lǐng)域、環(huán)境微生物學(xué)中被廣泛應(yīng)用，也極大的擴(kuò)展了生物冶金技術(shù)的研究空間。熒光原位雜交技術(shù)能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù)的缺陷，還能客觀的反映微生物在實(shí)驗(yàn)室或自然條件下的數(shù)量及空間分布等，對(duì)于生物冶金的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

5 結(jié)語(yǔ)

盡管熒光原位雜交技術(shù)在生物冶金應(yīng)用的過(guò)程中，會(huì)受到一些技術(shù)問(wèn)題的困擾，例如：熒光信號(hào)弱、背景熒光強(qiáng)度高導(dǎo)致分辨率較低、對(duì)于生長(zhǎng)緩慢的微生物細(xì)胞很難檢測(cè)等一系列問(wèn)題，但是FISH技術(shù)可以聯(lián)合其他技術(shù)的應(yīng)用，加上其高度的靈敏性，仍可以為微生物檢測(cè)提供更多的信息，被廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物、濕法冶金等研究領(lǐng)域，對(duì)于深入、完整地進(jìn)行生物冶金方面的理論研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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