雌馬酚制備、檢測(cè)和富集技術(shù)研究進(jìn)展

劉賀，許新月，劉軍，崔懷田，徐嘉鑫，袁治恒，李君，朱丹實(shí)

（1．渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121013；2.遼寧省糧谷類(lèi)食品生物高效轉(zhuǎn)化工程研究中心，遼寧 錦州 121013；3.生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；4.山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司，山東 禹城 251200）

1932年Marrian和Haslewood在懷孕雌馬的尿液中發(fā)現(xiàn)了一種非甾族類(lèi)異黃酮物質(zhì)雌馬酚（equol，Eq），確定其分子式為 C15H14O3，分子量為 242.27[1]。由于雌馬酚首次被發(fā)現(xiàn)是在雌馬的尿液中，并且經(jīng)檢測(cè)結(jié)果證明是馬體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，所以最終命名為雌馬酚。1984年Axelson等[2]在人體尿液中也發(fā)現(xiàn)了雌馬酚，并且對(duì)雌馬酚的來(lái)源進(jìn)行研究分析，結(jié)果表明雌馬酚是大豆異黃酮的代謝產(chǎn)物，其表現(xiàn)出的生物活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大豆異黃酮，有研究表明，萌發(fā)期的大豆胚軸是高活性雌馬酚的最佳來(lái)源[3]。

雌馬酚是具有S、R兩種對(duì)應(yīng)異構(gòu)體的外消旋型化合物，通常人體通過(guò)腸道菌群代謝作用產(chǎn)生的雌馬酚為S型，而通過(guò)人工可合成S、R型兩種混合外消旋體化合物。雌馬酚的生物活性主要包括抗氧化、雌激素和抗雌激素兩方面[4]。當(dāng)人體內(nèi)激素分泌不足，雌馬酚的S、R型可分別與雌激素受體ER-α和ER-β結(jié)合[5]，為機(jī)體補(bǔ)充激素；而機(jī)體激素分泌過(guò)剩時(shí)，又可與雌激素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)，以降低雌激素分泌過(guò)多對(duì)人體帶來(lái)的負(fù)面影響[6]。有研究表明，雌馬酚具有更高的抗氧化活性[7]和雌激素活性[8]，并且其抗氧化活性要強(qiáng)于大豆苷元[9]。在病理學(xué)領(lǐng)域，對(duì)于雌馬酚的生理功能的研究結(jié)果表明，雌馬酚具有預(yù)防骨質(zhì)疏松[10]、乳腺癌[11]、前列腺癌[12]以及神經(jīng)保護(hù)[13]的功能。

雖已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，如大鼠、小鼠、猴子、豬等研究結(jié)果表明，在食用大豆異黃酮類(lèi)食品后能產(chǎn)生較高水平的雌馬酚[14]，但由于雌馬酚在不同個(gè)體之間的產(chǎn)生水平不同，并不是所有人都能夠?qū)⒋蠖巩慄S酮代謝為雌馬酚，其中的原因可能是腸道菌群、膳食結(jié)構(gòu)、年齡及其性別的不同，導(dǎo)致人體產(chǎn)生雌馬酚的水平存在巨大差異[15]。研究顯示，由于個(gè)體微生物組成的不同，僅有30%～60%的人群可以將大豆異黃酮或異黃酮衍生物轉(zhuǎn)化為雌馬酚[16]，而對(duì)于其他一部分人群則需外源性補(bǔ)充才能滿足人體對(duì)其需求，因此高效快速的制備和檢測(cè)方法是十分重要的。近年來(lái)，研究者重點(diǎn)研究了通過(guò)天然微生物代謝產(chǎn)生雌馬酚的途徑，相繼從人體、小鼠、猴子、豬等動(dòng)物糞便中分離出與雌馬酚代謝相關(guān)菌株，如Asaccharobacter celatus，Adlercreutzia equolifaciens，Slackia isoflavoniconvertens，Enterorhabdus mucosicola[17]，還有研究者在一些食物中通過(guò)各種技術(shù)手段分離、純化、發(fā)酵富集雌馬酚，如大豆飲料、葛根[18]，為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)雌馬酚提供了廣闊的前景。本研究主要對(duì)雌馬酚的制備方法、檢測(cè)方法、微生物發(fā)酵富集技術(shù)進(jìn)行總結(jié)，以期為雌馬酚的深入研究提供一定的幫助。

1 雌馬酚的制備

雖然通過(guò)調(diào)整膳食結(jié)構(gòu)可以為人體提供雌馬酚，但這只針對(duì)30%～60%的雌馬酚產(chǎn)生者有效，而對(duì)于其他一部分人群則需通過(guò)外源性補(bǔ)充滿足人體對(duì)雌馬酚的需求，因此開(kāi)發(fā)有效的雌馬酚體外合成方法是十分必要的，目前體外合成雌馬酚的方法主要有化學(xué)合成法、微生物合成法和生物學(xué)合成法。

1.1 化學(xué)合成方法

化學(xué)合成法主要是以異黃酮和化學(xué)試劑為基礎(chǔ)，利用烷基化、傅克?；?、氫化、Witting反應(yīng)原理合成制備雌馬酚。Muthyal等[19]首先提出以現(xiàn)成的異黃酮前體物質(zhì)-大豆苷元為原料，利用轉(zhuǎn)移氫化和仿生合成技術(shù)最終通過(guò)色譜拆分法分離出雌馬酚。不過(guò)該方法需要雙乙酸鹽、甲酸銨、乙酸等多種化學(xué)試劑，還原過(guò)程難以控制，并且會(huì)涉及多個(gè)步驟或涉及多種化學(xué)試劑甚至是有毒試劑，造成雌馬酚制備成本大幅度提高；Heemstra等[20]則通過(guò)烷基化反應(yīng)得到雌馬酚的中心結(jié)構(gòu)，然后利用分子布赫瓦爾德醚化得到苯并二氫吡喃環(huán)，此種方法單批次中雌馬酚產(chǎn)率達(dá)到9.8%，但是此方法過(guò)程復(fù)雜，且涉及多種昂貴的化學(xué)試劑，不適合用于雌馬酚的工業(yè)化生產(chǎn)；以間甲氧基苯酚和對(duì)羥基苯乙酸為原料在100℃，三氟化硼乙醚的存在下發(fā)生傅克酰化反應(yīng)也可以合成雌馬酚，此方法雖然簡(jiǎn)單，但總回收率較低，在反應(yīng)過(guò)程中會(huì)有多種化學(xué)物質(zhì)的產(chǎn)生，不易與目標(biāo)產(chǎn)物分離，也難以得到純物質(zhì)[21]；Li等[22]提出了一種新的合成策略，以間苯二酚為原料合成雌馬酚，此種方法包括一系列Wittig反應(yīng)、烷基化反應(yīng)，從而生成異黃酮中間體。盡管這種策略能夠提高效率，并提供了這些生物活性化合物的途徑，但最終產(chǎn)品雌馬酚是一種外消旋化合物，并且使用的試劑較昂貴，不適合工業(yè)化放大生產(chǎn)；為了提高雌馬酚的總收率，Takashima 等[23]提出了一種由 L-（-）-乳酸乙酯通過(guò)順序反應(yīng)合成雌馬酚的方法。合成的關(guān)鍵在于烯丙基取代，經(jīng)過(guò)11個(gè)反應(yīng)步驟，（S）-雌馬酚的產(chǎn)率提高到31.6%；Yang等[24]開(kāi)發(fā)了一種高效的銥催化的不對(duì)稱氫化反應(yīng)方法，雌馬酚的總收率可以達(dá)到48.4%，目前所有的化學(xué)合成方法都存在收率低、步驟繁瑣等缺點(diǎn)。

1.2 微生物制備法

科研人員在雌馬酚的早期研究中發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)在無(wú)菌環(huán)境中的小鼠和新生嬰兒在食用豆類(lèi)食品后，其代謝產(chǎn)物中檢測(cè)不到雌馬酚的存在[25]。經(jīng)研究者的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，將小鼠和人的糞便進(jìn)行厭氧混合培養(yǎng)時(shí)，能夠?qū)⒋蠖巩慄S酮或異黃酮衍生物轉(zhuǎn)化為雌馬酚[26]。盡管?chē)X類(lèi)動(dòng)物食用大豆類(lèi)物質(zhì)后，在其代謝產(chǎn)物中可以檢測(cè)到雌馬酚的存在，但經(jīng)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于每天食用豆類(lèi)食品的人而言，僅約有25%～30%的年輕人體內(nèi)代謝可以產(chǎn)生雌馬酚，在西方素食者的年輕人中，“雌馬生產(chǎn)者”所占比例為50%～60%[27]。Wang等[28]第一次從人類(lèi)糞便中分離出能夠?qū)⒍浯蠖管赵╠ihydrodaidzein，DHD）轉(zhuǎn)化為雌馬酚的革蘭氏陰性菌株SNU Julong 732，以此確定了人體內(nèi)雌馬酚的代謝與腸道微生物直接相關(guān)。目前人和小鼠腸道內(nèi)產(chǎn)雌馬酚的細(xì)菌是研究者們關(guān)注的重點(diǎn)，隨著研究者對(duì)雌馬酚代謝與腸道菌群關(guān)系的深入研究發(fā)現(xiàn)，一些腸道微生物作用于大豆異黃酮類(lèi)物質(zhì)時(shí)并不能代謝產(chǎn)生雌馬酚，而是產(chǎn)生轉(zhuǎn)化途徑中的一些中間物，如DHD和二氫黃素（dihydrogenistein，DHG），而另一些腸道微生物只能利用大豆異黃酮的中間代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為雌馬酚，由此可以推斷出一些腸道菌只是參與雌馬酚產(chǎn)生途徑中的部分環(huán)節(jié)，并不能獨(dú)立將異黃酮類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為雌馬酚。

目前鼠源產(chǎn)雌馬酚菌主要有 do03、LH-52、ATCC9338、Mt1B8。Minamida 等[29]通過(guò)對(duì)小鼠糞便的分離培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)了能夠?qū)⒋蠖巩慄S酮素轉(zhuǎn)化為雌馬酚的菌株，并進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果證明為一株革蘭氏陽(yáng)性厭氧菌，將其命名為do03；Matthies等[30]則從小鼠腸道中分離鑒定出一種兼性厭氧菌，可在有氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)，完成雌馬酚的代謝過(guò)程；Tamura等[31]通過(guò)對(duì)小鼠腸道內(nèi)菌群的研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳桿菌ATCC9338可以代謝大豆苷元，促進(jìn)雌馬酚的產(chǎn)生，并進(jìn)一步影響腸道菌群。除了以上鼠源產(chǎn)雌馬酚菌外，研究者也相繼從其他動(dòng)物，如豬、雞、鴨、猴子等身上分離培養(yǎng)產(chǎn)雌馬酚菌。與從動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)雌馬酚菌數(shù)量相比，人源性產(chǎn)雌馬酚菌數(shù)量更多。Maruo等[32]從人類(lèi)糞便中分離出9株能夠?qū)慄S酮轉(zhuǎn)化為雌馬酚的菌株，其中7株菌株能通過(guò)二氫大豆苷元代謝成雌馬酚，其他2株菌株僅能通過(guò)二氫大豆苷元代謝成雌馬酚，并將其劃分為一個(gè)新屬，命名為Adlercreutzia equolifaciens sp.nov。同期Jin等[33]也從人類(lèi)糞便中分離出菌株P(guān)UE和DZE，通過(guò)對(duì)PUE和DZE的共同培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)其可以把葛根素轉(zhuǎn)化為S-雌馬酚，說(shuō)明在多種產(chǎn)雌馬酚相關(guān)菌的協(xié)同作用下，可促進(jìn)雌馬酚的代謝；Tsuji等[34]還從人類(lèi)糞便中成功分離出一株能夠?qū)⒋蠖管赵D(zhuǎn)化為雌馬酚的革蘭氏陽(yáng)性菌，命名為Slackia sp.strain NATTS；隨后，Park等[35]從人類(lèi)糞便中分離出一株革蘭氏陰性菌，該菌株只參與雌馬酚代謝過(guò)程的一部分，可以將大豆苷元和染料木素等異黃酮類(lèi)物質(zhì)代謝為R-二氫異黃酮；Flórez等[36]對(duì)人體腸道細(xì)菌 DSM19450T的研究發(fā)現(xiàn)，DSM19450T培養(yǎng)10 h后可將大豆苷元完全代謝。然而，在添加異黃酮的環(huán)境中培養(yǎng)只有約三分之一可以轉(zhuǎn)化為二氫大豆苷元，然后轉(zhuǎn)化為雌馬酚；Yusuke等[37]從日本一名健康女性的糞便中分離出一株強(qiáng)效產(chǎn)雌馬酚的菌株，并對(duì)其進(jìn)行了基因組序列的研究，最終將其命名為Adlercreutzia sp.Strain 8CFCBH1。目前分離報(bào)道的產(chǎn)雌馬酚菌株主要涉及Bifidobacterium、Enterococcus、Eggerthella、Asaccharobacter、Lactobacillus、Lactococcus、Adlercreutzia、Eubacterium、Acinetobacter和Slackia[38]10個(gè)屬。雖然天然微生物發(fā)酵法必須在嚴(yán)格厭氧條件下進(jìn)行，并且雌馬酚產(chǎn)生菌發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，但是此方法在大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)雌馬酚方面已經(jīng)顯示出了廣闊的發(fā)展前景。

1.3 生物學(xué)合成法

隨著基因測(cè)序和基因工程的快速發(fā)展，生物學(xué)合成方法為快速、高效地生產(chǎn)雌馬酚帶來(lái)了希望。將大豆苷元轉(zhuǎn)化成雌馬酚的生物合成途徑中主要包括4個(gè)催化酶：大豆苷元還原酶（daidzein reductase，DZNR）、二氫大豆苷元還原酶（dihydrodaidzein reductase，DHDR）、四氫大豆苷元還原酶（tetrahydrodaidzein reductase，THDR）和二氫大豆苷元外消旋酶（dihydrodaidzein racemase，DDRC）[39]。Shimada 等[40]研究發(fā)現(xiàn)，體外將大豆苷元轉(zhuǎn)化為雌馬酚至少需要上述4種關(guān)鍵性的代謝酶，以上4種代謝酶混合作用于大豆苷元中，可以使大豆苷元轉(zhuǎn)化為雌馬酚的轉(zhuǎn)化率達(dá)到89.4%，而當(dāng)缺失DDRC時(shí)，轉(zhuǎn)化率大幅度降低到15.3%；Yuika等[41]在YY7918菌株中發(fā)現(xiàn)了DZNR、DHDR和THDR 3種酶，其基因序列與上述已知的4種關(guān)鍵代謝酶基因相似性高達(dá)99%，將此3種酶與大豆苷元進(jìn)行混合發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果未檢測(cè)到雌馬酚。

近年來(lái)，關(guān)于異源生物合成雌馬酚的相關(guān)研究逐漸增多，Gao等[42]從Slackia sp中構(gòu)建了含有大豆苷元和染料木素還原酶基因（dgr）的重組大腸桿菌，成功地進(jìn)行了需氧生物合成DHD和DHG；Lee等[43]從菌株Slackia isoflavoniconvertens DSM22006中克隆了相關(guān)轉(zhuǎn)化酶基因，并且在重組大腸桿菌中利用P212A對(duì)DHDR進(jìn)行定點(diǎn)突變，結(jié)果表明，重組菌產(chǎn)雌馬酚能力增強(qiáng)。（S）-雌馬酚等大豆異黃酮類(lèi)衍生物對(duì)多種菌的生長(zhǎng)代謝具有一定抑制作用。因此在菌株代謝產(chǎn)生雌馬酚時(shí)要注意雌馬酚對(duì)于代謝菌的影響，避免由雌馬酚引起的抑制菌株生長(zhǎng)的情況。Vázquez等[44]通過(guò)共表達(dá)雌馬酚產(chǎn)生基因 L-ddrc、L-dznr、L-dhdr和 L-thdr，構(gòu)建一種能夠產(chǎn)生（S）-雌馬酚的抗性宿主大腸桿菌；Mao等[45]通過(guò)構(gòu)建轉(zhuǎn)座子突變文庫(kù)篩選出了一株（S）-雌馬酚抗性大腸桿菌BL21（ydiS）菌株，可以克服（S）-雌馬酚對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用，提高雌馬酚的體外產(chǎn)量，并且通過(guò)細(xì)菌全基因組掃描測(cè)序和體外表達(dá)首次鑒定出導(dǎo)致對(duì)（S）-雌馬酚能夠產(chǎn)生抗性的氧化還原酶基因ydiS。上述3種雌馬酚合成方法的分析如表1所示。

表1 雌馬酚合成方法匯總分析Table 1 Summary and analysis of synthetic methods of equol

2 雌馬酚的檢測(cè)

隨著近幾年對(duì)雌馬酚的深入研究，其檢測(cè)方法也不斷增多，主要有以下幾種檢測(cè)方法。

酶標(biāo)記免疫吸附測(cè)定法：酶標(biāo)記免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）是以抗原和抗體分子為測(cè)定靶標(biāo)的方法，測(cè)定原理是利用被測(cè)底物被酶催化反應(yīng)后形成有色物質(zhì)，根據(jù)顏色的深淺程度對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析。ELISA操作簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，靈敏度較高，但是有時(shí)會(huì)出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。Sébastien等[48]對(duì)12名健康的志愿者進(jìn)行了隨機(jī)、雙盲、雙向交叉實(shí)驗(yàn)，通過(guò)ELISA測(cè)定染料木素、大豆苷元及其代謝產(chǎn)物雌馬酚的血漿和尿濃度。

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法：氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS） 是一種結(jié)合氣相色譜和質(zhì)譜的特性，依據(jù)不同物質(zhì)在流動(dòng)相和固定相相互作用而產(chǎn)生不同的分配效率，在試樣中分離并檢測(cè)不同物質(zhì)的方法。Kenneth等[49]通過(guò)此方法檢測(cè)了素食主義者和非素食主義者兩類(lèi)人群攝入大豆后血清和尿液中雌馬酚類(lèi)型。

液相色譜質(zhì)譜法：液相色譜質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometer，LC-MS） 可以根據(jù)離子質(zhì)荷比的大小將組分進(jìn)行分離鑒定，并且能夠分離分析復(fù)雜有機(jī)混合物。Elghali等[50]通過(guò)LC-MS研究短雙歧桿菌15700和長(zhǎng)雙歧桿菌BB536對(duì)大豆黃酮轉(zhuǎn)化為雌馬酚的影響。

紫外分光光度法：利用物質(zhì)能夠吸收其波長(zhǎng)范圍內(nèi)的折射光，致使電子能級(jí)發(fā)生躍遷而產(chǎn)生吸收光譜，最終對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析的方法。該方法重現(xiàn)性好，靈敏度高，操作簡(jiǎn)易，準(zhǔn)確性較高，檢測(cè)速度較快。李笑梅等[51]在對(duì)多個(gè)健康素食者腸道中的產(chǎn)雌馬酚菌生長(zhǎng)條件優(yōu)化的研究中，利用該方法測(cè)定雌馬酚的含量。

高效液相色譜法：高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）是利用被測(cè)物與流動(dòng)相及固定相間產(chǎn)生的吸附、排阻等作用的大小不同，從而使不同組分按照先后順序從固定相中流出，最終實(shí)現(xiàn)分離和檢測(cè)目的。高效液相色譜法靈敏度高，流速高，分離效率高，適用于大分子、熱不穩(wěn)定性的物質(zhì)。Gaya等[52]采用高效液相色譜紫外檢測(cè)器法檢測(cè)植物雌激素，如異黃酮、鞣花單寧、木脂素，高效液相色譜電噴霧質(zhì)譜法鑒定色譜峰，并與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和紫外光譜特征進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證；Mao等[45]為提高S-雌馬酚的產(chǎn)量，構(gòu)建一種S-雌馬酚抗性大腸桿菌，在研究中采用HPLC測(cè)定雌馬酚產(chǎn)量。

3 雌馬酚的富集

在醫(yī)藥、食品、化學(xué)等研究領(lǐng)域針對(duì)雌馬酚能夠降低心血管風(fēng)險(xiǎn)，較其前體物質(zhì)具有較高的抗氧化活性和抗癌活性等優(yōu)點(diǎn)[53-54]，進(jìn)行了部分合成富集試驗(yàn)，但由于化學(xué)合成過(guò)程中需要使用價(jià)格昂貴的化學(xué)試劑，副產(chǎn)物多，難以分離純化，所以導(dǎo)致化學(xué)合成的雌馬酚售價(jià)較高。研究者為解決上述化學(xué)合成法中的諸多問(wèn)題，為能夠讓雌馬酚快速、高效地在食品、人體中得到富集，不斷發(fā)展微生物發(fā)酵、生物學(xué)方法來(lái)富集雌馬酚。Jeong等[55]對(duì)新型產(chǎn)雌馬酚菌副干酪乳桿菌JS1的基因進(jìn)行分析，并通過(guò)使用副干酪乳桿菌JS1發(fā)酵玫瑰花提取物（fermentation of the P.lobata extract，F(xiàn)PE）研究對(duì)皮膚和腸道免疫應(yīng)答的影響，結(jié)果表明，經(jīng)JS1發(fā)酵后FPE中產(chǎn)生了對(duì)皮膚有益的雌馬酚，此外FPE對(duì)大腸的炎癥因子也有一定的抑制作用，因此新型食用產(chǎn)雌馬酚副干酪乳桿菌JS1和FPE可用于營(yíng)養(yǎng)、美容類(lèi)物質(zhì)中以此達(dá)到富集雌馬酚的目的；ángela等[18]研究了在pNZ：TuR.dzr質(zhì)粒的強(qiáng)組成啟動(dòng)子下，探索了由Slackia isoflavoniconvertens DSM22006衍生的大豆苷元還原酶基因在9株乳酸菌和雙歧桿菌中的異源表達(dá)，結(jié)果表明，所有轉(zhuǎn)化菌株均能從大豆苷元、染料木素和大豆飲料中的異黃酮苷中獲得高產(chǎn)DHD 和 DHG，另外，乳球菌 MG1363 pNZ：TuR.dzr在大腸環(huán)境中表達(dá)重組大豆苷元還原酶，可促進(jìn)產(chǎn)雌馬酚腸道微生物的產(chǎn)量，而其他重組菌株對(duì)腸道微生物生產(chǎn)雌馬酚的影響作用則相反。該重組菌株對(duì)開(kāi)發(fā)富含DHD和DHG的發(fā)酵大豆飲料具有一定的價(jià)值，并且可以達(dá)到促進(jìn)腸道微生物產(chǎn)生雌馬酚和5-羥基雌馬酚的目的；Mustafa等[56]通過(guò)體外試驗(yàn)研究了商品益生元（果寡糖和菊粉）和糖（葡萄糖和蔗糖）對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌BB536和短雙歧桿菌ATCC 15700將豆奶中異黃酮轉(zhuǎn)化為雌馬酚的影響，結(jié)果顯示，菊粉對(duì)雌馬酚的產(chǎn)生影響最大，在添加菊粉的豆?jié){中，長(zhǎng)雙歧桿菌BB536和短雙歧桿菌ATCC15700共培養(yǎng)可提高雌馬酚的含量，最高達(dá)11.49 mmol/L。通過(guò)以上研究結(jié)果表明，可以通過(guò)提高豆?jié){中生物活性成分的生物利用度來(lái)提高豆?jié){營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的同時(shí)提高雌馬酚的產(chǎn)量。由于異黃酮生物轉(zhuǎn)化菌催化的還原反應(yīng)，生物合成過(guò)程絕大部分必須在專性厭氧條件下進(jìn)行，為克服轉(zhuǎn)化菌對(duì)氧敏感的問(wèn)題，Gao等[57]通過(guò)從Slackia sp.AUH-JLC159中克隆了大豆苷元和染料木素還原酶基因（dgr），首次將重組大腸桿菌（E.coli）全細(xì)胞作為生物催化劑，結(jié)果表明重組大腸桿菌全細(xì)胞對(duì)大豆苷元或染料木素的最大轉(zhuǎn)化濃度從0.4 mmol/L提高到1.4 mmol/L，重組大腸桿菌全細(xì)胞是一種高效的生物催化劑，在好氧條件下也能生物合成異黃酮代謝物；Lee等[43]通過(guò)克隆Slackia isoflavoniconvertens DSM22006中參與生物合成的4種酶到大腸桿菌BL21（DE3）菌株中，然后將菌體制備成10倍靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系，當(dāng)?shù)孜餅榇蠖管赵獣r(shí)，可實(shí)現(xiàn)85%的轉(zhuǎn)化率，Lee等[58]又將上述的重組菌株以相同的條件作用于染料木素，實(shí)現(xiàn)了95%的轉(zhuǎn)化率。

目前雌馬酚的富集主要通過(guò)天然微生物發(fā)酵（可添加益生元共同作用）和生物學(xué)手段，通過(guò)雙歧桿菌、副干酪乳桿菌對(duì)相應(yīng)底物進(jìn)行發(fā)酵，使得基質(zhì)中雌馬酚產(chǎn)量增加，解決了人工化學(xué)合成帶來(lái)的高成本、難分離純化的問(wèn)題，但微生物發(fā)酵也存在著一定問(wèn)題，如發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)而產(chǎn)率低。在大豆異黃酮轉(zhuǎn)化過(guò)程中，轉(zhuǎn)化菌催化的生化反應(yīng)中至少有一步為還原反應(yīng)，因此這就要求轉(zhuǎn)化菌必須在嚴(yán)格厭氧的條件下進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵，所以導(dǎo)致菌株培養(yǎng)條件較難控制。通過(guò)基因工程或者利用發(fā)酵與多種生物學(xué)手段相結(jié)合的方式富集雌馬酚，達(dá)到了高效、快速合成雌馬酚的目的。上述研究中利用基因重組構(gòu)建耐氧突變菌株，達(dá)到了產(chǎn)雌馬酚菌株在好氧條件仍能高效合成雌馬酚的目的。國(guó)內(nèi)外對(duì)于耐氧菌株的研究極少，雖然上述研究已經(jīng)重組構(gòu)建出耐氧菌，但是該耐氧菌株在有氧條件下生長(zhǎng)緩慢，所以目前對(duì)于構(gòu)建出既能夠正常生長(zhǎng)又能高效轉(zhuǎn)化雌馬酚的耐氧菌株是實(shí)現(xiàn)雌馬酚高效、快速生產(chǎn)的關(guān)鍵。

4 總結(jié)與展望

雌馬酚是異黃酮類(lèi)物質(zhì)的腸道微生物代謝產(chǎn)物，諸多研究已經(jīng)表明其具有多種藥理活性，并且其自身還可以促進(jìn)產(chǎn)雌馬酚腸道微生物生產(chǎn)雌馬酚。越來(lái)越多的人已經(jīng)認(rèn)識(shí)到雌馬酚對(duì)于人體的有益作用，因此研究者開(kāi)始了對(duì)雌馬酚不斷的深入研究。目前，雌馬酚的人工化學(xué)合成方法已經(jīng)得到了極大的改善，但仍然存在成本高、反應(yīng)過(guò)程復(fù)雜、難分離純化等關(guān)鍵性的問(wèn)題，所以通過(guò)化學(xué)合成的雌馬酚主要用于研究大豆異黃酮代謝產(chǎn)物的性質(zhì)，因而并沒(méi)有得到大規(guī)模的生產(chǎn)和使用。未來(lái)對(duì)于雌馬酚的研究最重要的是研發(fā)更加高效、快速的制備方法，構(gòu)建耐氧突變菌株和優(yōu)化有氧轉(zhuǎn)化工藝，為雌馬酚的有氧合成提供新的耐氧突變菌，是進(jìn)一步提高雌馬酚的合成效率和實(shí)現(xiàn)雌馬酚的高效有氧合成的關(guān)鍵。同時(shí)，研究者還應(yīng)著眼于通過(guò)膳食提升人體產(chǎn)雌馬酚的能力以及補(bǔ)充產(chǎn)雌馬酚菌株來(lái)實(shí)現(xiàn)非雌馬酚產(chǎn)生者的轉(zhuǎn)變等方向，并借助宏基因組學(xué)、代謝組學(xué)等多種組學(xué)分析技術(shù)來(lái)進(jìn)一步闡明雌馬酚的產(chǎn)生通路及與人體腸道菌群的相互作用關(guān)系，以此實(shí)現(xiàn)雌馬酚更深入的研究。